Ang mga immunomodulatory metabolites isa ka yabi nga bahin sang tumor microenvironment (TME), apang sa pila ka mga eksepsiyon, ang ila mga identidad nagapabilin nga wala mahibaluan. Diri, gin-analisar namon ang mga tumor kag T cells gikan sa mga tumor kag ascites sang mga pasyente nga may high-grade serous carcinoma (HGSC) agud ipahayag ang metabolome sining nagkalainlain nga mga kompartimento sang TME. Ang mga ascites kag mga selula sang tumor may malapad nga mga kinatuhayan sa metabolite. Kon ipaanggid sa ascites, ang mga tumor-infiltrating T cells labi nga ginpauswag sa 1-methylnicotinamide (MNA). Bisan pa ang lebel sang MNA sa T cells mataas, ang ekspresyon sang nicotinamide N-methyltransferase (isa ka enzyme nga naga-catalyze sang pagbalhin sang mga grupo sang methyl gikan sa S-adenosylmethionine pakadto sa nicotinamide) limitado sa mga fibroblast kag mga selula sang tumor. Sa pag-obra, ang MNA naga-induce sang mga T cells sa pag-secrete sang tumor-promoting cytokine tumor necrosis factor alpha. Gani, ang TME-derived MNA nagaamot sa regulasyon sang immune sang T cells kag nagarepresentar sang isa ka potensyal nga target sang immunotherapy para sa pagbulong sang kanser sang tawo.
Ang mga metabolite nga naghalin sa tumor mahimo nga may daku nga epekto sa pagpugong sa anti-tumor immunity, kag nagadamo ang ebidensya nga nagapakita nga mahimo man sila magserbe nga yabi nga nagapahulag nga pwersa para sa pag-uswag sang balatian (1). Magluwas sa epekto sang Warburg, ang bag-o nga trabaho nagsugod sa pagkilala sang metaboliko nga kahimtangan sang mga selula sang tumor kag ang kaangtanan sini sa kahimtangan sang imyunidad sang tumor microenvironment (TME). Ang mga pagtuon sa mga modelo sang ilaga kag mga T cell sang tawo nagpakita nga ang metabolismo sang glutamine (2), metabolismo sang oxidative (3) kag metabolismo sang glucose (4) mahimo nga maghulag sing independiente sa nagkalainlain nga mga subgrupo sang immune cell. Ang pila ka mga metabolite sa sini nga mga alagyan nagapugong sang anti-tumor nga pagpanghikot sang mga selula sang T. Napamatud-an nga ang pagbalabag sang coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) makahalit sa pagdamo sang T cells, kag ang pagdugang sang BH4 sa lawas makapauswag sang anti-tumor immune response nga ginapatunga sang CD4 kag CD8. Dugang pa, ang immunosuppressive nga epekto sang kynurenine mahimo nga maluwas paagi sa pagdumala sang BH4 (5). Sa isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, ang pagtago sang enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) nagapugong sang T cell activation, proliferation kag cytolysis Activity (6). Sining karon lang, ginpakita nga ang methylglyoxal, isa ka by-product sang glycolysis, ginahimo sang mga suppressor cells sang myeloid nga ginhalinan, kag ang T cell transfer sang methylglyoxal makapugong sang effector T cell function. Sa pagbulong, ang pag-neutralize sang methylglyoxal makadaug sa aktibidad sang myeloid-derived suppressor cells (MDSC) kag synergisticly nga makapauswag sang checkpoint blockade therapy sa mga modelo sang ilaga (7). Ini nga mga pagtuon nagatingob nga nagapadaku sang yabi nga papel sang mga metabolite nga naghalin sa TME sa pag-regulate sang T cell function kag activity.
Ang T cell dysfunction lapnag nga ginreport sa kanser sa obaryo (8). Ini bangud sa metaboliko nga mga kinaiya nga yara sa hypoxia kag abnormal nga tumor vasculature (9), nga nagaresulta sa pagbag-o sang glucose kag tryptophan sa mga by-product pareho sang lactic acid kag kynurenine. Ang sobra nga extracellular lactate nagapanubo sang produksyon sang interferon-γ (IFN-γ) kag nagatulod sang pagkatuhay sang myelosuppressive subgroups (10, 11). Ang pagkonsumo sang tryptophan direkta nga nagapugong sang pagdamo sang T cell kag nagapugong sang signaling sang receptor sang T cell (12-14). Bisan pa sa sini nga mga obserbasyon, madamo nga buluhaton sa palibot sang immune metabolism ang ginhimo sa in vitro T cell culture gamit ang optimized media, ukon limitado sa homologous mouse models in vivo, nga wala sa sini ang bug-os nga nagapakita sang heterogeneity sang mga kanser sang tawo kag Physiological macro kag micro nga palibot.
Ang kinaandan nga bahin sang kanser sa obaryo amo ang paglapta sang peritoneal kag ang pagtuhaw sang ascites. Ang pagtipon sang pluido sang selula sa ascites may kaangtanan sa abanse nga balatian kag indi maayo nga prognosis (15). Suno sa mga report, ining pinasahi nga kompartimento hypoxic, may mataas nga lebel sang vascular endothelial growth factor (VEGF) kag indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), kag ginasulod sang T regulatory cells kag myeloid inhibitory cells (15-18). Ang metaboliko nga palibot sang ascites mahimo nga tuhay sa iya sang tumor mismo, gani ang pag-reprogram sang mga T cells sa peritoneal space indi maathag. Dugang pa, ang mga yabi nga kinatuhayan kag heterogeneity sa tunga sang ascites kag mga metabolites nga yara sa palibot sang tumor mahimo nga makaupang sa pagsulod sang mga selula sang immune kag ang ila pag-obra sa mga tumor, kag kinahanglan ang dugang nga pagpanalawsaw.
Agod masolbar ining mga problema, nagdesinyo kami sang isa ka sensitibo nga pagbulag sang selula kag liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) nga pamaagi sa pagtuon sang nagkalainlain nga mga sahi sang selula (lakip ang CD4 + kag CD8 + T cells) subong man sa sulod kag sa tunga sang mga tumor Ang mga metabolite sini nagasangkad sa mga selula sa pareho nga ascites kag tumor nga palibot sang pasyente. Ginagamit namon ini nga pamaagi upod sa high-dimensional flow cytometry kag single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) sa paghatag sang isa ka mataas nga naresolbar nga laragway sang metaboliko nga kahimtangan sining mga yabi nga populasyon. Ini nga pamaagi nagpakita sang isa ka daku nga pagtaas sa lebel sang 1-methylnicotinamide (MNA) sa mga tumor T cells, kag ang mga eksperimento sa vitro nagpakita nga ang immunomodulatory nga epekto sang MNA sa T cell function wala pa mahibal-an sang una. Sa kabilugan, ini nga pamaagi nagapakita sang mutual metabolic interactions sa tunga sang mga tumor kag mga selula sang imyunidad, kag nagahatag sang pinasahi nga mga panan-awan sa mga metabolite sa regulasyon sang imyunidad, nga mahimo mapuslanon para sa pagbulong sang T cell-based ovarian cancer immunotherapy Treatment opportunities.
Naggamit kami sang high-dimensional flow cytometry sa dungan nga pag-isip sang glucose uptake [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) kag mitochondrial activity [MitoTracker Deep Red (MT DR) (MT DR, 2017, 2019) yara sa kilid tipikal nga mga marker nga nagapatuhay sang mga selula sang imyunidad kag mga populasyon sang selula sang tumor (Table S2 kag Figure S1A). Ini nga pag-analisar nagpakita nga kon ipaanggid sa mga T cell, ang ascites kag tumor cells may mas mataas nga lebel sang pagkuha sang glucose, apang may mas gamay nga mga kinatuhayan sa aktibidad sang mitochondrial. Ang average nga pagkuha sang glucose sang mga selula sang tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] tatlo tubtob apat ka pilo sangsa mga selula sang T, kag ang average nga pagkuha sang glucose sang mga selula sang CD4 + T 1.2 ka pilo sangsa mga selula sang CD8 + T, nga nagapakita nga ang mga tumor infiltrating lymphocytes (TIL) may lainlain nga mga kinahanglanon sa metabolismo bisan sa pareho nga figure TAME (Figure 1). Sa kabaliskaran, ang aktibidad sang mitochondrial sa mga selula sang tumor kaanggid sa mga selula sang CD4 + T, kag ang aktibidad sang mitochondrial sang duha ka sahi sang selula mas mataas sangsa mga selula sang CD8 + T (Figure 1B). Sa kabilugan, ini nga mga resulta nagapakita sang lebel sang metabolismo. Ang metaboliko nga aktibidad sang mga selula sang tumor mas mataas sangsa CD4 + T cells, kag ang metaboliko nga aktibidad sang CD4 + T cells mas mataas sangsa CD8 + T cells. Bisan pa sa sini nga mga epekto sa mga sahi sang selula, wala sing dalayon nga kinatuhayan sa metaboliko nga kahimtangan sang CD4 + kag CD8 + T nga mga selula ukon ang ila relatibo nga mga proporsyon sa ascites kon ipaanggid sa mga tumor (Figure 1C). Sa kabaliskaran, sa CD45-cell fraction, ang proporsyon sang EpCAM+ cells sa tumor nagdugang kon ipaanggid sa ascites (Figure 1D). Nakita man namon ang maathag nga kinatuhayan sa metabolismo sa tunga sang EpCAM+ kag EpCAM- cell components. Ang mga selula sang EpCAM+ (tumor) may mas mataas nga pagkuha sang glucose kag aktibidad sang mitochondrial sangsa mga selula sang EpCAM-, nga mas mataas sangsa metaboliko nga aktibidad sang mga fibroblast sa mga selula sang tumor sa TME (Figure 1, E kag F).
(A kag B) Median fluorescence intensity (MFI) sang glucose uptake (2-NBDG) (A) kag mitochondrial activity sang CD4 + T cells (MitoTracker dark red) (B) Representative graphs (wala) kag tabulated data (Right), CD8 + T cells kag EpCAM + CD45-tumor cells kag tumor cites bilang tumor. (C) Ang ratio sang CD4 + kag CD8 + nga mga selula (sang CD3 + T nga mga selula) sa ascites kag tumor. (D) Proporsyon sang EpCAM + tumor cells sa ascites kag tumor (CD45−). (E kag F) EpCAM + CD45-tumor kag EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) kag mitochondrial activity (MitoTracker dark red) (F) representative graphs (wala) kag tabulated data ( Right) Ascites kag tumor cells. (G) Mga representante nga graph sang CD25, CD137 kag PD1 nga ekspresyon paagi sa flow cytometry. (H kag I) CD25, CD137 kag PD1 nga ekspresyon sa CD4 + T cells (H) kag CD8 + T cells (I). (J kag K) Naive, central memory (Tcm), effector (Teff) kag effector memory (Tem) nga mga phenotype base sa ekspresyon sang CCR7 kag CD45RO. Mga representante nga mga laragway (wala) kag tabular data (tuo) sang CD4 + T cells (J) kag CD8 + T cells (K) sa ascites kag mga tumor. Ang mga balor sang P nga napat-od paagi sa ginpares nga t-test (*P<0.05, **P<0.01 kag ***P<0.001). Ang linya nagarepresentar sang mga pasyente nga ginpares (n = 6). FMO, fluorescence minus one; MFI, median nga intensidad sang fluorescence.
Ang dugang nga pag-analisar nagpakita sang iban pa nga importante nga mga kinatuhayan sa tunga sang mataas nga nasolbar nga T cell phenotypic status. Ang na-activate (Figure 1, G to I) kag effector memory (Figure 1, J kag K) sa mga tumor mas masunson sangsa ascites (proporsyon sang CD3 + T cells). Sing kaanggid, ang pag-analisar sang phenotype paagi sa ekspresyon sang mga marker sang pagpaaktibo (CD25 kag CD137) kag mga marker sang pag-ubos [programmed cell death protein 1 (PD1)] nagpakita nga bisan pa ang mga kinaiya sang metabolismo sining mga populasyon magkatuhay (Figure S1, B to E), Apang wala sing makahulugan nga metaboliko nga mga kinatuhayan ang dalayon nga naobserbahan sa tunga sang naive, ukon subor nga mga epekto sa memorya (Figure S1, F1 AKO). Ini nga mga resulta ginkumpirma paagi sa paggamit sang mga pamaagi sa pagtuon sang makina sa awtomatiko nga pag-assign sang mga phenotype sang selula (21), nga dugang nga nagpakita sang presensya sang madamo nga mga selula sang utok sang tul-an (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) sa ascites sang pasyente (Figure S2A ). Sa tanan nga nakilala nga mga sahi sang selula, ining populasyon sang myeloid cell nagpakita sang pinakamataas nga pagkuha sang glucose kag aktibidad sang mitochondrial (Figure S2, B tubtob G). Ini nga mga resulta nagapakita sang mabaskog nga mga kinatuhayan sa metabolismo sa tunga sang madamo nga mga sahi sang selula nga makita sa ascites kag mga tumor sa mga pasyente sang HGSC.
Ang panguna nga hangkat sa paghangop sang mga kinaiya sang metabolismo sang TIL amo ang kinahanglanon nga ipain ang mga sample sang T cell nga may bastante nga kaputli, kalidad kag kadamuon gikan sa mga tumor. Ang mga pagtuon sining karon lang nagpakita nga ang mga pamaagi sa pag-sort kag pagpauswag sang bead base sa flow cytometry mahimo magdul-ong sa mga pagbag-o sa mga profile sang cellular metabolite (22-24). Agod malandas ini nga problema, gin-optimize namon ang pamaagi sa pagpauswag sang bead sa pag-isolate kag pag-isolate sang TIL gikan sa surgical resected human ovarian cancer antes ang pag-analisar paagi sa LC-MS/MS (tan-awa ang Materials and Methods; Figure 2A). Agod mahibaluan ang kabug-usan nga epekto sini nga protocol sa mga pagbag-o sa metabolite, ginkumparar namon ang mga profile sang metabolite sang mga T cells nga gin-activate sang mapagros nga mga donor pagkatapos sang nasambit nga tikang sa pagbulag sang bead sa mga selula nga wala ginbulag sang bead apang nagpabilin sa yelo. Ini nga pag-analisar sang pagkontrol sang kalidad nakakita nga may mataas nga kaangtanan sa tunga sining duha ka kondisyon (r = 0.77), kag ang teknikal nga pagsulit sang grupo sang 86 ka mga metabolite may mataas nga pagsulit (Figure 2B). Gani, ini nga mga pamaagi makahimo sang sibu nga pag-analisar sang metabolite sa mga selula nga nagapaidalom sa pagpauswag sang sahi sang selula, gani nagahatag sang una nga mataas nga resolusyon nga plataporma para sa pagkilala sang partikular nga mga metabolite sa HGSC, sa amo nagahatag sa mga tawo sang mas madalom nga paghangop sang espesipiko nga selula Sexual metabolism program.
(A) Schematic diagram sang magnetic bead enrichment. Antes ang pag-analisar paagi sa LC-MS/MS, ang mga selula magaagi sa tatlo ka sunod-sunod nga hugna sang magnetic bead enrichment ukon magapabilin sa yelo. (B) Ang epekto sang sahi sang pagpauswag sa kadamuon sang mga metabolite. Ang average sang tatlo ka mga pagsukol para sa tagsa ka sahi sang pagpauswag ± SE. Ang abohon nga linya nagarepresentar sang 1:1 nga relasyon. Ang intra-class correlation (ICC) sang sulitsulit nga mga pagsukol nga ginapakita sa label sang axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Schematic diagram sang workflow sang pag-analisar sang metabolite sang pasyente. Ang mga ascites ukon mga tumor ginakuha gikan sa mga pasyente kag gina-cryopreserve. Ang gamay nga bahin sang tagsa ka sample gin-analisar paagi sa flow cytometry, samtang ang nabilin nga mga sample nag-agi sa tatlo ka hugna sang pagpauswag para sa CD4+, CD8+ kag CD45- nga mga selula. Ining mga bahin sang selula gin-analisar gamit ang LC-MS/MS. (D) Mapa sang init sang standardized nga kadamuon sang metabolite. Ang dendrogram nagarepresentar sang pagtipon ni Ward sang mga distansya sang Euclidean sa tunga sang mga sample. (E) Pag-analisar sang panguna nga bahin (PCA) sang mapa sang metabolite sang sample, nga nagapakita sang tatlo ka replika sang tagsa ka sample, ang mga sample gikan sa pareho nga pasyente ginaangot sang isa ka linya. (F) Ang PCA sang profile sang metabolite sang sample nga ginkondisyon sa pasyente (ie, gamit ang partial redundancy); ang sample type limitado sa convex hull. PC1, panguna nga bahin 1; PC2, panguna nga bahin 2.
Masunod, gin-aplikar namon ini nga pamaagi sa pagpauswag sa pag-analisar sang 99 ka mga metabolite sa CD4 +, CD8 + kag CD45-cell fractions sa panguna nga ascites kag mga tumor sang anom ka mga pasyente sang HGSC (Figure 2C, Figure S3A kag Table S3 kag S4). Ang populasyon sang interes nagabug-os sang 2% tubtob 70% sang orihinal nga daku nga sample sang buhi nga mga selula, kag ang proporsyon sang mga selula nagalainlain sing daku sa tunga sang mga pasyente. Pagkatapos nga mapain ang mga kuwintas, ang ginpauswag nga bahin sang interes (CD4+, CD8+ ukon CD45-) nagabug-os sang kapin sa 85% sang tanan nga buhi nga mga selula sa sample sa promedyo. Ini nga pamaagi sa pagpauswag nagatugot sa aton sa pag-analisar sang mga populasyon sang selula gikan sa metabolismo sang tisyu sang tumor sang tawo, nga imposible nga himuon gikan sa dalagku nga mga sample. Gamit ini nga protocol, napat-od namon nga ang l-kynurenine kag adenosine, ining duha ka maayo nga kinaiya nga immunosuppressive metabolites ginpataas sa tumor T cells ukon tumor cells (Figure S3, B kag C). Gani, ini nga mga resulta nagapakita sang katutom kag ikasarang sang aton pagbulag sang selula kag teknolohiya sang mass spectrometry sa pagpangita sang importante nga mga metabolite sa biolohiya sa mga tisyu sang pasyente.
Ang amon pag-analisar nagpakita man sang mabaskog nga metaboliko nga pagbulagay sang mga sahi sang selula sa sulod kag sa tunga sang mga pasyente (Figure 2D kag Figure S4A). Sa partikular, kon ipaanggid sa iban nga mga pasyente, ang pasyente 70 nagpakita sang lainlain nga mga kinaiya sa metabolismo (Figure 2E kag Figure S4B), nga nagapakita nga mahimo nga may yara sang substansiyal nga metaboliko nga heterogeneity sa tunga sang mga pasyente. Dapat talupangdon nga kon ipaanggid sa iban nga mga pasyente (1.2 tubtob 2 ka litro; Table S1), ang kabug-usan nga kadamuon sang ascites nga nakolekta sa pasyente 70 (80 ml) mas gamay. Ang pagkontrol sang inter-patient heterogeneity sa tion sang pag-analisar sang panguna nga bahin (halimbawa, gamit ang partial redundancy analysis) nagapakita sang nagakaigo nga mga pagbag-o sa tunga sang mga sahi sang selula, kag ang mga sahi sang selula kag/ukon microenvironment maathag nga gintingob suno sa profile sang metabolite (Figure 2F ). Ang pag-analisar sang isa ka metabolite nagpadaku sining mga epekto kag nagpakita sang daku nga mga kinatuhayan sa tunga sang mga sahi sang selula kag microenvironment. Dapat talupangdon nga ang pinakagrabe nga kinatuhayan nga naobserbahan amo ang MNA, nga sa masami ginapauswag sa CD45- cells kag sa CD4+ kag CD8+ cells nga nagasulod sa tumor (Figure 3A). Para sa CD4 + cells, ini nga epekto labing maathag, kag ang MNA sa CD8 + cells daw mabaskog man nga apektado sang palibot. Apang, indi ini importante, bangod tatlo lamang sa anom ka pasyente ang mahimo ma-ebalwar para sa tumor CD8+ scores. Magluwas sa MNA, sa nagkalainlain nga sahi sang mga selula sa ascites kag mga tumor, ang iban nga mga metabolite nga indi maayo nga ginakilala sa TIL may yara man sang kinalain nga manggaranon (Mga Pigura S3 kag S4). Gani, ini nga mga datos nagapakita sang isa ka nagapanaad nga hugpong sang mga immunomodulatory metabolites para sa dugang nga pagpanalawsaw.
(A) Normalized nga kaundan sang MNA sa CD4+, CD8+ kag CD45- nga mga selula gikan sa ascites kag tumor. Ang box plot nagapakita sang median (linya), interquartile range (frame hinge) kag data range, tubtob sa 1.5 ka pilo sang interquartile range (frame whisker). Subong sang ginlaragway sa Patient Materials and Methods, gamita ang limma value sang pasyente sa pagdeterminar sang P value (*P<0.05 kag **P<0.01). (B) Schematic diagram sang metabolismo sang MNA (60). Mga metabolite: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Mga enzyme (berde): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE sang scRNA-seq sang ascites (grey) kag tumor (pula; n = 3 ka pasyente). (D) NNMT nga ekspresyon sa nagkalainlain nga populasyon sang selula nga nakilala gamit ang scRNA-seq. (E) Ekspresyon sang NNMT kag AOX1 sa SK-OV-3, human embryonic kidney (HEK) 293T, T cells kag MNA-treated T cells. Ang napilo nga ekspresyon ginapakita nga may kaangtanan sa SK-OV-3. Ang pattern sang ekspresyon nga may SEM ginapakita (n = 6 ka mapagros nga mga donor). Ang mga balor sang Ct nga labaw sa 35 ginakabig nga indi makita (UD). (F) Ekspresyon sang SLC22A1 kag SLC22A2 sa SK-OV-3, HEK293T, T cells kag T cells nga ginbulong sang 8mM MNA. Ang napilo nga ekspresyon ginapakita nga may kaangtanan sa SK-OV-3. Ang pattern sang ekspresyon nga may SEM ginapakita (n = 6 ka mapagros nga mga donor). Ang mga balor sang Ct nga mas mataas sa 35 ginakabig nga indi makita (UD). (G) Ang kaundan sang MNA sang selula sa gin-activate nga mapagros nga donor T cells pagkatapos sang 72 ka oras nga paglumlom upod sa MNA. Ang pattern sang ekspresyon nga may SEM ginapakita (n = 4 ka mapagros nga mga donor).
Ang MNA ginahimo paagi sa pagbalhin sang methyl group gikan sa S-adenosyl-1-methionine (SAM) pakadto sa nicotinamide (NA) paagi sa nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figure 3B). Ang NNMT sobra nga ginapabutyag sa nagkalainlain nga mga kanser sang tawo kag may kaangtanan sa pagdamo, pagsalakay kag metastasis (25-27). Agod mas mahangpan ang ginhalinan sang MNA sa T cells sa TME, gingamit namon ang scRNA-seq sa pagkilala sang ekspresyon sang NNMT sa mga sahi sang selula sa ascites kag mga tumor sang tatlo ka mga pasyente sang HGSC (Table S5). Ang pag-analisar sang ginabanta 6,500 ka mga selula nagpakita nga sa mga palibot sang ascites kag tumor, ang ekspresyon sang NNMT ginlimitahan sa ginapatihan nga populasyon sang fibroblast kag tumor cell (Figure 3, C kag D). Talalupangdon nga wala sing maathag nga ekspresyon sang NNMT sa bisan ano nga populasyon nga nagapabutyag sang PTPRC (CD45 +) (Figure 3D kag Figure S5A), nga nagapakita nga ang MNA nga natukiban sa metabolite spectrum ginpakilala sa T cells. Ang ekspresyon sang aldehyde oxidase 1 (AOX1) nagabaylo sang MNA sa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) ukon 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); Ang Figure 3B) ginalimitahan man sa populasyon sang mga fibroblast nga nagapabutyag sang COL1A1 (Figure S5A), nga kon tingbon nagapakita nga ang mga selula sang T kulang sa ikasarang sang naandan nga metabolismo sang MNA. Ang pattern sang ekspresyon sining mga gene nga may kaangtanan sa MNA gin-verify gamit ang ikaduha nga independente nga cell data set gikan sa ascites gikan sa mga pasyente sang HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). Dugang pa, ang quantitative polymerase chain reaction (qPCR) nga pag-analisar sang mapagros nga donor T cells nga ginabulong sang MNA nagpakita nga kon ipaanggid sa control SK-OV-3 ovarian tumor cells, ang NNMT ukon AOX1 halos wala ginpahayag (Figure 3E). Ining wala ginapaabot nga mga resulta nagapakita nga ang MNA mahimo nga ginapaguwa gikan sa mga fibroblast ukon mga tumor pakadto sa kaiping nga mga T cell sa TME.
Bisan pa ang mga kandidato nagalakip sang pamilya sang organic cation transporters 1 tubtob 3 (OCT1, OCT2 kag OCT3) nga gin-encode sang soluble carrier 22 (SLC22) nga pamilya (SLC22A1, SLC22A2 kag SLC22A3), ang mga potensyal nga transporters sang MNA wala pa mahangpan (28) . Ang QPCR sang mRNA gikan sa mapagros nga donor T cells nagpakita sang manubo nga lebel sang ekspresyon sang SLC22A1 apang indi makita nga lebel sang SLC22A2, nga nagpamatuod nga ini ginreport na sang una sa literatura (Figure 3F) (29). Sa kabaliskaran, ang SK-OV-3 ovarian tumor cell line nagpabutyag sang mataas nga lebel sang duha ka mga transporter (Figure 3F).
Agod testingan ang posibilidad nga ang mga T cells may ikasarang sa pagsuyop sang dumuluong nga MNA, ang mga mapagros nga donor T cells ginkultibar sa sulod sang 72 ka oras sa presensya sang nagkalainlain nga konsentrasyon sang MNA. Sa pagkawala sang exogenous MNA, ang cellular content sang MNA indi makita (Figure 3G). Apang, ang mga activated T cells nga ginabulong sang exogenous MNA nagpakita sang dose-dependent nga pagtaas sa MNA content sa mga selula, tubtob sa 6 mM MNA (Figure 3G). Ini nga resulta nagapakita nga walay sapayan sang manubo nga lebel sang ekspresyon sang transporter kag kakulang sang panguna nga enzyme nga responsable sa metabolismo sang intracellular MNA, ang TIL mahimo gihapon magkuha sang MNA.
Ang spectrum sang mga metabolite sa mga T cells sang mga pasyente kag ang mga eksperimento sa pagsuyop sang MNA sa vitro nagapataas sang posibilidad nga ang mga fibroblast nga may kaangtanan sa kanser (CAF) nagapaguwa sang MNA kag ang mga selula sang tumor mahimo nga mag-regulate sang phenotype kag function sang TIL. Agod mahibaluan ang epekto sang MNA sa T cells, ang mapagros nga donor T cells gin-aktibo sa vitro sa presensya ukon wala sang MNA, kag ang ila pagdamo kag produksyon sang cytokine gin-ebalwar. Pagkatapos sang 7 ka adlaw nga pagdugang sang MNA sa pinakamataas nga dosis, ang numero sang pagdoble sang populasyon kasarangan nga nagnubo, samtang ang kabaskog ginpadayon sa tanan nga dosis (Figure 4A). Dugang pa, ang pagbulong sang exogenous MNA nagresulta sa pagdugang sang proporsyon sang CD4 + kag CD8 + T cells nga nagapahayag sang tumor necrosis factor-α (TNFα; Figure 4B). Sa kabaliskaran, ang intracellular nga produksyon sang IFN-γ nagnubo sing daku sa CD4 + T cells, apang indi sa CD8 + T cells, kag wala sing daku nga pagbag-o sa interleukin 2 (IL-2; Figure 4, C kag D). Gani, ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sang mga supernatant gikan sa sini nga mga MNA-treated T cell cultures nagpakita sang isa ka daku nga pagtaas sa TNFα, isa ka pagnubo sa IFN-γ, kag wala sing pagbag-o sa IL-2 (Figure 4, E to G). . Ang pagnubo sang IFN-γ nagapakita nga ang MNA mahimo nga may papel sa pagpugong sang anti-tumor nga aktibidad sang T cells. Agod ma-simulate ang epekto sang MNA sa T cell-mediated cytotoxicity, ang chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) cells nga nagapuntirya sa folate receptor α kag CAR-T (GFP) nga gina-regulate sang green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) cells ginahimo sang healthy donor peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Ang mga selula sang CAR-T ginkultibar sa sulod sang 24 ka oras sa presensya sang MNA, kag dayon ginkultibar upod sa mga selula sang tumor sa obaryo sang tawo nga SK-OV-3 nga nagapabutyag sang folate receptor α sa isa ka effector sa target nga ratio nga 10:1. Ang pagtambal sang MNA nagresulta sa isa ka daku nga pagnubo sa pagpatay nga aktibidad sang FRα-CAR-T nga mga selula, nga kaanggid sa FRα-CAR-T nga mga selula nga ginbulong sang adenosine (Figure 4H).
(A) Kabug-usan nga viable cell count kag pagdoble sang populasyon (PD) direkta gikan sa kultura sa adlaw 7. Ang bar graph nagarepresentar sang mean + SEM sang anom ka mapagros nga mga donor. Nagarepresentar sang datos gikan sa indi magkubos sa n = 3 ka independiente nga mga eksperimento. (B to D) Ang CD3/CD28 kag IL-2 gingamit sa pag-aktibo sang mga T cells sa ila tagsa ka konsentrasyon sang MNA sa sulod sang 7 ka adlaw. Antes sang pag-analisar, ang mga selula ginpukaw sang PMA/ionomycin nga may GolgiStop sa sulod sang 4 ka oras. TNFα (B) nga ekspresyon sa T cells. Halimbawa nga laragway (wala) kag tabular data (tuo) sang ekspresyon sang TNFα sa buhi nga mga selula. IFN-γ (C) kag IL-2 (D) nga ekspresyon sa T cells. Ang ekspresyon sang mga cytokine gintakus paagi sa flow cytometry. Ang bar graph nagarepresentar sang mean (n = 6 healthy donors) + SEM. Gamita ang isa ka paagi nga pag-analisar sang variance kag sulitsulit nga mga pagsukol (*P<0.05 kag **P<0.01) sa pagdeterminar sang P value. Nagarepresentar sang datos gikan sa indi magkubos sa n = 3 ka independiente nga mga eksperimento. (E to G) Ang CD3/CD28 kag IL-2 gingamit sa pag-aktibo sang mga T cells sa ila tagsa ka konsentrasyon sang MNA sa sulod sang 7 ka adlaw. Ang medium gintipon antes kag pagkatapos sang 4 ka oras sang PMA/ionomycin stimulation. Ang mga konsentrasyon sang TNFα (E), IFN-γ (F) kag IL-2 (G) gintakus paagi sa ELISA. Ang bar graph nagarepresentar sang mean (n = 5 healthy donors) + SEM. Ang bili sang P nga napat-od gamit ang isa ka paagi nga pag-analisar sang pagkatuhay kag sulitsulit nga mga pagsukol (*P<0.05). Ang tuldok nga linya nagapakita sang limitasyon sang pagtukib sang pagtukib. (H) Cell lysis assay. Ang FRα-CAR-T ukon GFP-CAR-T nga mga selula gin-adjust gamit ang adenosine (250μM) ukon MNA (10 mM) sa sulod sang 24 ka oras, ukon ginbilin nga wala ginabulong (Ctrl). Ang porsyento sang pagpatay sang mga selula sang SK-OV-3 gintakus. P value nga napat-od sang Welch t test (*P<0.5 kag **P<0.01).
Agod matigayon ang isa ka mekanikal nga paghangop sang MNA-dependent TNFα expression regulation, ang mga pagbag-o sa TNFα mRNA sang MNA-treated T cells gin-ebalwar (Figure 5A). Ang mga mapagros nga donor T cells nga ginabulong sang MNA nagpakita sang duha ka pilo nga pagtaas sa lebel sang transkripsyon sang TNFα, nga nagapakita nga ang MNA nagadepende sa regulasyon sang transkripsyon sang TNFα. Sa pag-usisa sini nga posible nga mekanismo sa regulasyon, duha ka nahibal-an nga mga transcription factors nga naga-regulate sang TNFα, nga amo ang activated T cell nuclear factor (NFAT) kag specific protein 1 (Sp1), ang gin-ebalwar bilang sabat sa MNA binding sa proximal TNFα promoter ( 30). Ang TNFα promoter nagaunod sang 6 ka nakilala nga NFAT binding sites kag 2 ka Sp1 binding sites, nga naga-overlap sa isa ka site [-55 base pairs (bp) gikan sa 5'cap] (30). Ang chromatin immunoprecipitation (ChIP) nagpakita nga kon ginabulong gamit ang MNA, ang pagbugkos sang Sp1 sa TNFα promoter nagdugang sing tatlo ka pilo. Ang paglakip sang NFAT nagdugang man kag nagpalapit sa importansya (Figure 5B). Ini nga mga datos nagapakita nga ang MNA naga-regulate sang ekspresyon sang TNFα paagi sa Sp1 transcription, kag sa mas manubo nga kasangkaron ang ekspresyon sang NFAT.
(A) Kon ipaanggid sa mga T cells nga ginkultibar nga wala sing MNA, ang pagbag-o sang TNFα nga ekspresyon sa mga T cells nga ginbulong sa MNA. Ang pattern sang ekspresyon nga may SEM ginapakita (n = 5 ka mapagros nga mga donor). Nagarepresentar sang datos gikan sa indi magkubos sa n = 3 ka independiente nga mga eksperimento. (B) Ang TNFα promoter sang T cells nga ginbulong nga may ukon wala sang 8 mM MNA pagkatapos sang NFAT kag Sp1 gintingob sa (Ctrl) kag PMA/ionomycin stimulation sa sulod sang 4 ka oras. Ang Immunoglobulin G (IgG) kag H3 gingamit bilang negatibo kag positibo nga mga kontrol para sa immunoprecipitation, sa magkatuhay. Ang pag-isip sang ChIP nagpakita nga ang pagbugkos sang Sp1 kag NFAT sa TNFα promoter sa mga selula nga ginbulong sang MNA nagdugang sing pila ka beses kon ipaanggid sa kontrol. Nagarepresentar sang datos gikan sa indi magkubos sa n = 3 ka independiente nga mga eksperimento. Ang balor sang P nga napat-od sang madamo nga t-tests (*** P <0.01). (C) Kon ipaanggid sa ascites sang HGSC, ang mga selula sang T (non-cytotoxic) nagpakita sang dugang nga ekspresyon sang TNF sa tumor. Ang mga kolor nagrepresentar sa lainlaing mga pasyente. Ang mga ginpakita nga mga selula gin-random nga gin-sample sa 300 kag gin-jitter agud limitahan ang overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Ginproponer nga modelo sang MNA para sa kanser sa obaryo. Ang MNA ginahimo sa mga selula sang tumor kag mga fibroblast sa TME kag ginakuha sang mga selula sang T. Ang MNA nagapadugang sang pagbugkos sang Sp1 sa TNFα promoter, nga nagadul-ong sa pagdugang sang TNFα transcription kag TNFα cytokine production. Ang MNA nagatuga man sang pagnubo sang IFN-γ. Ang pagpugong sa pagpanghikot sang T cell nagadul-ong sa pagnubo sang ikasarang sa pagpatay kag pagpadasig sang pagtubo sang tumor.
Suno sa mga report, ang TNFα may yara sang mga epekto sa atubang kag likod nga nagadepende sa anti-tumor kag anti-tumor, apang may yara ini sang kilala nga papel sa pagpasanyog sang pagtubo kag metastasis sang kanser sa obaryo (31-33). Suno sa mga report, ang konsentrasyon sang TNFα sa ascites kag mga tisyu sang tumor sa mga pasyente nga may kanser sa obaryo mas mataas sangsa mga tisyu nga benign (34-36). Sa bahin sang mekanismo, ang TNFα maka-regulate sang pagpaaktibo, pag-obra kag pagdamo sang puti nga mga selula sang dugo, kag magbag-o sang phenotype sang mga selula sang kanser (37, 38). Nahisanto sa sini nga mga natukiban, ang pag-analisar sang differential gene expression nagpakita nga ang TNF may daku nga pag-up-regulate sa mga T cells sa mga tisyu sang tumor kon ipaanggid sa ascites (Figure 5C). Ang pagdugang sa ekspresyon sang TNF makita lamang sa mga populasyon sang T cell nga may non-cytotoxic phenotype (Figure S5A). Sa pagsumaryo, ini nga mga datos nagasuporta sa pagtamod nga ang MNA may duha ka immunosuppressive kag tumor promoting effects sa HGSC.
Ang fluorescent labeling base sa flow cytometry nangin panguna nga pamaagi sa pagtuon sang metabolismo sang TIL. Ginpakita sini nga mga pagtuon nga kon ipaanggid sa mga peripheral blood lymphocytes ukon T cells gikan sa ikaduha nga mga organo sang lymphoid, ang murine kag human TIL may mas mataas nga huyog sa pagkuha sang glucose (4, 39) kag ang amat-amat nga pagkadula sang mitochondrial function (19, 40). Bisan pa nga naobserbahan namon ang kaanggid nga mga resulta sa sini nga pagtuon, ang yabi nga pag-uswag amo ang pagkumparar sang metabolismo sang mga selula sang tumor kag TIL gikan sa pareho nga gin-utod nga tisyu sang tumor. Nahisanto sa pila sining mga nagligad nga mga report, ang mga selula sang tumor (CD45-EpCAM +) gikan sa ascites kag mga tumor may mas mataas nga pagkuha sang glucose sangsa CD8 + kag CD4 + T cells, nga nagasuporta nga ang mataas nga pagkuha sang glucose sang mga selula sang tumor mahimo nga mapaanggid sa mga selula sang T. Ang konsepto sa kompetisyon sa T cell. TME. Apang, ang mitochondrial nga aktibidad sang mga selula sang tumor mas mataas sangsa CD8 + T cells, apang ang mitochondrial nga aktibidad kaanggid sa CD4 + T cells. Ini nga mga resulta nagapabakod sang nagautwas nga tema nga ang oxidative metabolism importante para sa mga selula sang tumor (41, 42). Ginapanugda man nila nga ang CD8 + T cells mahimo nga mas madali nga ma-oxidative dysfunction sangsa CD4 + T cells, ukon nga ang CD4 + T cells mahimo maggamit sang mga ginhalinan sang carbon magluwas sa glucose sa pagpadayon sang aktibidad sang mitochondrial (43, 44). Dapat talupangdon nga wala kami sing naobserbahan nga kinatuhayan sa pagkuha sang glucose ukon aktibidad sang mitochondrial sa tunga sang CD4 + T effectors, T effector memory kag T central memory cells sa ascites. Sing kaanggid, ang estado sang pagkatuhay sang CD8 + T cells sa mga tumor wala sing labot sa mga pagbag-o sa pagkuha sang glucose, nga nagapakita sang daku nga kinatuhayan sa tunga sang mga T cells nga ginkultibar sa vitro kag human TIL sa vivo (22). Ini nga mga obserbasyon ginkumpirma man paagi sa paggamit sang wala sing pinilian nga awtomatiko nga alokasyon sang populasyon sang selula, nga dugang nga nagpakita nga ang CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + nga mga selula nga may mas mataas nga pagkuha sang glucose kag aktibidad sang mitochondrial sangsa mga selula sang tumor lapnag apang may Metabolic active cell population. Ini nga populasyon mahimo nga nagarepresentar sang ginapatihan nga subpopulasyon sang myeloid suppressor cells ukon plasmacytoid dendritic cells nga nakilala sa scRNA-seq analysis. Bisan pa nga ini nga duha ginreport sa mga tumor sa obaryo sang tawo [45], kinahanglan pa nila ang dugang nga buluhaton amo ang paglaragway sa sini nga myeloid subpopulation.
Bisan pa ang mga pamaagi nga nakabase sa flow cytometry makapaathag sang pangkabilugan nga mga kinatuhayan sa glucose kag oxidative metabolism sa tunga sang mga sahi sang selula, ang eksakto nga mga metabolite nga ginahimo sang glucose ukon iban pa nga mga ginhalinan sang carbon para sa mitochondrial metabolism sa TME wala pa mapat-od. Ang pag-assign sang presensya ukon pagkawala sang mga metabolite sa isa ka ginhatag nga TIL subset nagakinahanglan sang pagtinlo sang populasyon sang selula gikan sa gin-utod nga tisyu. Gani, ang amon pamaagi sa pagpauswag sang selula nga gintingob sa mass spectrometry makahatag sang mga panan-awan sa mga metabolite nga lainlain nga ginpauswag sa mga T cells kag mga populasyon sang tumor cell sa pagtupong sang mga sample sang pasyente. Bisan pa nga ini nga pamaagi may mga bentaha sa fluorescence-activated cell sorting, ang pila ka mga librarya sang metabolite mahimo nga maapektuhan bangod sang kinaugali nga kalig-on kag/ukon madasig nga turnover rate (22). Walay sapayan, ang amon pamaagi nakakilala sang duha ka kilala nga immunosuppressive metabolites, adenosine kag kynurenine, bangod nagalainlain sila sing daku sa tunga sang mga sahi sang sample.
Ang amon metabolomic nga pag-analisar sang mga tumor kag TIL subtypes nagahatag sang dugang nga mga panan-awan sa papel sang mga metabolite sa ovarian TME. Una, gamit ang flow cytometry, napat-od namon nga wala sing kinatuhayan sa aktibidad sang mitochondrial sa tunga sang mga tumor kag CD4 + T cells. Apang, ang pag-analisar sang LC-MS/MS nagpakita sang daku nga mga pagbag-o sa kadamuon sang mga metabolite sa tunga sining mga populasyon, nga nagapakita nga ang mga konklusyon nahanungod sa metabolismo sang TIL kag ang kabug-usan nga metaboliko nga aktibidad sini nagakinahanglan sang maid-id nga interpretasyon. Ikaduha, ang MNA amo ang metabolite nga may pinakadaku nga kinatuhayan sa tunga sang CD45-cells kag T cells sa ascites, indi sa mga tumor. Gani, ang compartmentalization kag ang lokasyon sang tumor mahimo nga may lainlain nga epekto sa metabolismo sang TIL, nga nagapakita sang posible nga heterogeneity sa isa ka ginhatag nga microenvironment. Ikatlo, ang ekspresyon sang MNA-producing enzyme NNMT limitado sa CAF, nga amo ang mga selula sang tumor sa mas manubo nga kasangkaron, apang ang mga lebel sang MNA nga makita sa mga selula sang T nga naghalin sa tumor. Ang sobra nga pagpahayag sang NNMT sa ovarian CAF may nahibal-an nga epekto sa pagpasanyog sang kanser, sa bahin bangod sang pagpasanyog sang metabolismo sang CAF, pagsalakay sang tumor kag metastasis (27). Bisan pa ang kabug-usan nga lebel sang TIL kasarangan, ang ekspresyon sang NNMT sa CAF may kaangtanan sa Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype, nga may kaangtanan sa indi maayo nga prognosis (27, 46, 47). Sa katapusan, ang ekspresyon sang enzyme AOX1 nga responsable sa pagkaguba sang MNA limitado man sa populasyon sang CAF, nga nagapakita nga ang mga selula sang T kulang sa ikasarang sa pag-metabolize sang MNA. Ini nga mga resulta nagasuporta sa ideya nga bisan pa kinahanglan ang dugang nga trabaho sa pag-verify sini nga natukiban, ang mataas nga lebel sang MNA sa T cells mahimo nga nagapakita sang presensya sang isa ka immunosuppressive CAF microenvironment.
Bangod sang manubo nga lebel sang ekspresyon sang mga transporter sang MNA kag sang indi makita nga lebel sang mga yabi nga protina nga nadalahig sa metabolismo sang MNA, ang presensya sang MNA sa mga selula sang T wala ginapaabot. Ang NNMT ukon AOX1 wala makita paagi sa scRNA-seq nga pag-analisar kag target nga qPCR sang duha ka independiente nga mga cohort. Ini nga mga resulta nagapakita nga ang MNA wala gina-synthesize sang T cells, kundi ginasuyop gikan sa palibot nga TME. Ang mga eksperimento sa vitro nagapakita nga ang mga selula sang T may huyog sa pagtipon sang exogenous MNA.
Ang amon mga pagtuon sa vitro nagpakita nga ang exogenous MNA naga-induce sang ekspresyon sang TNFα sa T cells kag nagapauswag sang pagbugkos sang Sp1 sa TNFα promoter. Bisan pa ang TNFα may yara sang anti-tumor kag anti-tumor nga mga hilikuton, sa kanser sa obaryo, ang TNFα makapasanyog sang pagtubo sang kanser sa obaryo (31-33). Ang pag-neutralize sang TNFα sa ovarian tumor cell culture ukon ang pagdula sang TNFα signal sa mga modelo sang ilaga makapauswag sang TNFα-mediated inflammatory cytokine production kag makapugong sang pagtubo sang tumor (32, 35). Gani, sa sini nga kaso, ang TME-derived MNA mahimo nga mag-akto bilang isa ka pro-inflammatory metabolite paagi sa isa ka TNFα-dependent nga mekanismo paagi sa autocrine loop, sa amo nagapasanyog sang pagluntad kag paglapta sang kanser sa obaryo (31). Base sa sini nga posibilidad, ang TNFα blockade ginatun-an bilang isa ka potensyal nga terapyutik nga ahente para sa kanser sa obaryo (37, 48, 49). Dugang pa, ang MNA nagahalit sang cytotoxicity sang CAR-T cells sa ovarian tumor cells, nga nagahatag sang dugang nga ebidensya para sa MNA-mediated immune suppression. Sa kabilugan, ini nga mga resulta nagapakita sang isa ka modelo sa diin ang mga tumor kag mga selula sang CAF nagapaguwa sang MNA sa extracellular TME. Paagi sa (i) TNF-induced ovarian cancer growth stimulation kag (ii) MNA-induced T cell cytotoxic activity inhibition, mahimo ini nga may doble nga epekto sa tumor (Figure 5D).
Sa konklusyon, paagi sa pag-aplikar sang kombinasyon sang madasig nga pagpauswag sang selula, single-cell sequencing kag metabolic profiling, ini nga pagtuon nagpakita sang daku nga mga kinatuhayan sa immunometabolomic sa tunga sang mga tumor kag mga selula sang ascites sa mga pasyente sang HGSC. Ini nga komprehensibo nga pag-analisar nagpakita nga may mga kinatuhayan sa pagkuha sang glucose kag aktibidad sang mitochondrial sa tunga sang mga selula sang T, kag ginkilala ang MNA bilang isa ka non-cell autonomous immune regulatory metabolite. Ini nga mga datos may epekto sa kon paano ang TME nagaapektar sa metabolismo sang T cell sa mga kanser sang tawo. Bisan pa ang direkta nga kompetisyon para sa mga sustansya sa tunga sang mga T cells kag mga selula sang kanser ginreport, ang mga metabolite mahimo man mag-akto bilang indi direkta nga mga regulator sa pagpasanyog sang pag-uswag sang tumor kag posible nga magpugong sang mga sabat sang endogenous immune. Ang dugang nga paglaragway sang functional role sining mga regulatory metabolites mahimo nga magbukas sang alternatibo nga mga estratehiya para sa pagpauswag sang anti-tumor immune response.
Ang mga espesimen sang pasyente kag ang mga datos sa klinika nakuha paagi sa BC cancer tumor tissue repository nga ginsertipikaran sang Canadian Tissue Repository Network. Suno sa protocol nga gin-aprubahan sang BC Cancer Research Ethics Committee kag sang University of British Columbia (H07-00463), ang tanan nga mga espesimen sang mga pasyente kag mga datos sa klinika nakakuha sang may ihibalo nga nasulat nga pahanugot ukon pormal nga nag-waive sang ila pahanugot. Ang mga sample ginatago sa sertipikado nga BioBank (BRC-00290). Ang detalyado nga mga kinaiya sang pasyente makita sa Tables S1 kag S5. Para sa cryopreservation, ang scalpel ginagamit sa mekanikal nga pagdunot sang sample sang tumor sang pasyente kag dayon iduso ini sa 100-micron filter agud makakuha sang isa ka cell suspension. Ang ascites sang pasyente gin-centrifuge sa 1500 rpm sa sulod sang 10 minutos sa 4°C agud ma-pellet ang mga selula kag kuhaon ang supernatant. Ang mga selula nga nakuha gikan sa tumor kag ascites gin-cryopreserve sa 50% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) kag 10% dimethyl sulfoxide. Ining ginpreserbar nga mga suspensyon sang isa ka selula gintunaw kag gingamit para sa metabolomics kag pagdeterminar sang metabolite nga ginlaragway sa idalom.
Ang kompleto nga medium ginabug-usan sang 0.22 μm nga ginsala 50:50 nga gindugangan sang RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) nga gindugangan sang 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Penicillin Streptomycin (PenStrep) nga solusyon (Thermo Fisher Scientific) kag 50 μMB-mercaptoethanol. Ang AimV (Invitrogen) ginadugangan sang 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) kag 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Ang flow cytometer staining buffer ginabug-usan sang 0.22μm filtered phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) nga gindugangan sang 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma). Ang cell enrichment buffer ginabug-usan sang 0.22μm nga ginsala nga PBS kag gindugangan sang 0.5% nga heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich).
Sa 37°C nga kompleto nga medium, ang mga selula gin-stain sang 10 nM MT DR kag 100 μM 2-NBDG sa sulod sang 30 minutos. Masunod, ang mga selula ginmantsahan sang viability dye eF506 sa 4°C sa sulod sang 15 minutos. I-resuspend ang mga selula sa FC Block (eBioscience) kag Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), lasaw sa flow cytometer staining buffer (suno sa mga instruksyon sang manufacturer), kag i-incubate sa sulod sang 10 minutos sa temperatura sang kwarto. Mantsahan ang mga selula gamit ang isa ka hugpong sang mga antibodies (Table S2) sa flow cytometry staining buffer sa 4°C sa sulod sang 20 minutos. I-resuspend ang mga selula sa flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) antes mag-analisar. Gamita ang SpectroFlo kag FlowJo V10 sa pag-analisar sang datos sang pag-isip sang selula, kag gamita ang GraphPad Prism 8 sa paghimo sang datos. Ang median fluorescence intensity (MFI) sang 2-NBDG kag MT DR gin-log-normalize, kag dayon ang isa ka paired t test gingamit para sa statistical analysis agud ma-account ang mga matched patients. Kuhaa ang tanan nga populasyon nga may mas manubo sa 40 ka mga hitabo gikan sa pag-analisar; magsulod sang MFI nga balor nga 1 para sa bisan ano nga negatibo nga mga balor antes maghimo sang pag-analisar sang estadistika kag pag-visualize sang datos.
Agod madugangan ang manual gating nga estratehiya sang panel sang proseso sa ibabaw, gingamit namon ang bug-os nga anotasyon sang shape restriction tree (FAUST) (21) sa awtomatiko nga pag-assign sang mga selula sa populasyon pagkatapos nga madula ang mga patay nga selula sa FlowJo. Manu-mano namon nga ginadumalahan ang output sa pagtingob sang mga populasyon nga daw wala gin-alokar (nga nagatingob sang PD1+ upod sa mga selula sang PD1-tumor) kag gintipigan nga mga populasyon. Ang tagsa ka sample nagaunod sang average nga kapin sa 2% nga mga selula, para sa kabug-usan nga 11 ka populasyon.
Ang Ficoll gradient density centrifugation gingamit sa pagseparar sang PBMC gikan sa mga produkto sang pagseparar sang leukocyte (STEMCELL Technologies). Ang CD8 + T cells gin-isolate gikan sa PBMC gamit ang CD8 MicroBeads (Miltenyi) kag ginpasangkad sa kompleto nga medium gamit ang TransAct (Miltenyi) sa sulod sang 2 ka semana suno sa mga instruksyon sang manufacturer. Ang mga selula gintugutan nga magtindog sa sulod sang 5 ka adlaw sa kompleto nga medium nga may IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), kag dayon gin-re-stimulate gamit ang TransAct. Sa ika-7 nga adlaw, suno sa mga instruksyon sang manufacturer, ang human CD45 MicroBeads (Miltenyi) gingamit sa pagpauswag sang mga selula sa tatlo ka sunod-sunod nga hugna. Ang mga selula gin-aliquot para sa pag-analisar sang flow cytometry (subong sang ginlaragway sa ibabaw), kag isa ka milyon ka mga selula ang gin-aliquot sing tatlo ka beses para sa pag-analisar sang LC-MS/MS. Ang mga sample ginproseso paagi sa LC-MS/MS suno sa ginlaragway sa idalom. Ginbulubanta namon ang nadula nga bili sang metabolite nga may numero sang ion nga 1,000. Ang tagsa ka sample gina-normalize sang kabug-usan nga numero sang ion (TIC), ginabaylo sa logarithmically kag awtomatiko nga gina-normalize sa MetaboAnalystR antes sang pag-analisar.
Ang single cell suspension sang tagsa ka pasyente gintunaw kag ginsala paagi sa 40 μm nga filter pakadto sa kompleto nga medium (subong sang ginlaragway sa ibabaw). Suno sa protocol sang manufacturer, tatlo ka sunod-sunod nga hugna sang positibo nga pagpili paagi sa magnetic bead separation gamit ang MicroBeads (Miltenyi) ang gingamit sa pagpauswag sang mga sample para sa CD8+, CD4+ kag CD45- cells (sa yelo). Sa malip-ot nga pulong, ang mga selula ginasuspende liwat sa cell enrichment buffer (subong sang ginlaragway sa ibabaw) kag ginaisip. Ang mga selula gin-incubate upod sa human CD8 beads, human CD4 beads ukon human CD45 beads (Miltenyi) sa 4°C sa sulod sang 15 minutos, kag dayon ginhugasan gamit ang cell enrichment buffer. Ang sample ginapasa sa LS column (Miltenyi), kag ang positibo kag negatibo nga mga bahin ginatipon. Agod mabuhinan ang kalawigon kag mapadaku ang tikang sa pagbawi sang selula, ang CD8-fraction ginagamit dayon para sa ikaduha nga hugna sang CD4+ nga pagpauswag, kag ang CD4-fraction ginagamit para sa masunod nga CD45-enrichment. Ibutang ang solusyon sa yelo sa bug-os nga proseso sang pagbulag.
Agod mahanda ang mga sample para sa pag-analisar sang metabolite, ang mga selula ginhugasan sing makaisa gamit ang ice-cold salt solution, kag 1 ml sang 80% methanol ang gindugang sa tagsa ka sample, dayon gin-vortex kag gin-snap frozen sa likido nga nitroheno. Ang mga sample ginpaidalom sa tatlo ka siklo sang pagyelo-pagtunaw kag gin-centrifuge sa 14,000 rpm sa sulod sang 15 minutos sa 4°C. Ang supernatant nga nagaunod sang mga metabolite ginaalisngaw tubtob nga magmala. Ang mga metabolite gintunaw liwat sa 50 μl sang 0.03% formic acid, gin-vortex agud magsamo, kag dayon gin-centrifuge agud kuhaon ang mga tinumpag.
Kuhaa ang mga metabolite suno sa ginlaragway sa ibabaw. Isaylo ang supernatant sa isa ka mataas nga performance nga botelya sang liquid chromatography para sa pagpanalawsaw sa metabolomics. Maggamit sang random nga protocol sa pagtratar sa tagsa ka sample nga may pareho nga kadamuon sang mga selula agud malikawan ang mga epekto sang batch. Naghimo kami sang isa ka kwalitatibo nga pagtimbangtimbang sang mga pangkalibutanon nga mga metabolite nga ginbalhag na sang una sa AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Ang pag-analisar sang chromatographic kag ang pag-integrar sang peak area ginhimo gamit ang MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Ang ion count nga 1000 gingamit sa pagbanta sang nadula nga bili sang metabolite, kag ang TIC sang tagsa ka sample gingamit sa pagkalkulo sang normalized peak area sang tagsa ka natukiban nga metabolite sa pagtadlong para sa mga pagbag-o nga ginpakilala sang instrumental nga pag-analisar gikan sa pagproseso sang sample. Pagkatapos nga ma-normalize ang TIC, ang MetaboAnalystR(51) (default parameter) ginagamit para sa logarithmic conversion kag automatic norm line scaling. Gingamit namon ang PCA nga may vegan R package sa paghimo sang pag-usisa sang mga kinatuhayan sa metabolome sa tunga sang mga sahi sang sample, kag naggamit sang partial redundancy analysis sa pag-analisar sang mga pasyente. Gamita ang pamaagi ni Ward sa paghimo sang heat map dendrogram sa pag-cluster sang Euclidean nga distansya sa tunga sang mga sample. Gingamit namon ang limma (52) sa standardized metabolite abundance sa pagkilala sang differentially abundant metabolites sa bug-os nga cell type kag microenvironment. Agod mapasimple ang paathag, ginagamit namon ang group mean parameter sa pagtumod sang modelo, kag ginabinagbinag ang mga sahi sang selula sa microenvironment subong sang tagsa ka grupo (n = 6 ka grupo); para sa pagtilaw sang kahulugan, naghimo kami sang tatlo ka sulitsulit nga pagsukol para sa tagsa ka metabolite Agod malikawan ang sayop nga pagkopya, ang pasyente ginlakip subong isa ka balagbag sa desinyo sang limma. Agod ma-usisa ang mga kinatuhayan sa mga metabolite sa tunga sang nagkalainlain nga mga pasyente, gin-adjust namon ang modelo sang limma nga nagalakip sang mga pasyente sa isa ka piho nga paagi. Ginareport namon ang kahulugan sang pre-specified nga kontras sa tunga sang sahi sang selula kag sang microenvironment sang Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction).
Pagkatapos sang pagpauswag sang kabaskugon gamit ang Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability), ang single-cell transcriptome sequencing ginhimo sa kabug-usan nga buhi nga nagyelo nga ascites kag mga sample sang tumor gamit ang 10x 5′gene expression protocol. Lima ka kaso nga may nagakaigo nga mga tumor kag ascites ang gin-analisar, bisan pa nga ang manubo nga viability gikan sa isa ka sample sang tumor nagpugong sa paglakip sini. Agod matigayon ang madamo nga pagpili sang mga pasyente, gintingob namon ang mga sample sang tagsa ka pasyente sa mga lane sang 10x chromium controller, kag gin-analisar ang mga ascites kag tumor sites sing separado. Pagkatapos sang pag-sequence [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; ang average nga 73,488 kag 41,378 ka pagbasa kada selula para sa tumor kag ascites]], gingamit namon ang CellSNP kag Vireo (53) (base sa CellSNP bilang Ang kinaandan nga human SNP (VCF) nga ginhatag sang GRCh38 ginhatagan sang donor identity. Ginagamit namon ang SNPRelate sa pag-infer sang pinakamalapit nga identidad (IBS) sang genotype sang mga pasyente (IBS) wala labot ang mga wala gin-assign nga mga selula kag mga selula nga ginkilala bilang mga duplex kag mga donor nga nagapares sa tunga sang mga sample sang ascites kag tumor (54). (2792 kag 4183 ka mga selula gikan sa tumor kag ascites, sa magkatuhay) para sa pag-analisar Ginagamit namon ang igraph's (57) Louvain clustering sang gin-ambit nga pinakamalapit nga network (SNN) base sa distansya sang Jaccard sa mga selula sang cluster paagi sa ekspresyon. ang mga selula ginahatagan kahulugan sang ekspresyon sang CD8A kag GZMA, wala labot ang mga subcluster nga may manubo nga ekspresyon sang protina sang ribosomal.
Ang PBMC ginseparar gikan sa mga produkto sang pagbulag sang leukocyte (STEMCELL Technologies) paagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga selula sang CD3 + gin-isolate gikan sa PBMC gamit ang CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya ukon pagkawala sang MNA, ang mga selula sang CD3+ gin-aktibo gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) kag IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Sa katapusan nga adlaw sang pagpasangkad, ang viability (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) kag ang pagdamo (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) gin-ebalwar paagi sa flow cytometry. Ebalwaron ang function sang effector paagi sa pagpukaw sang mga selula gamit ang PMA (20 ng/ml) kag ionomycin (1μg/ml) gamit ang GolgiStop sa sulod sang 4 ka oras, kag bantayan ang CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) kag TNFα-fluoresceinsothiansothianate (TCb1) (TCb1) BD). Pukawon ang qPCR kag ChIP cells gamit ang PMA (20 ng/ml) kag ionomycin (1μg/ml) sa sulod sang 4 ka oras. Ang ELISA supernatant gintipon antes kag pagkatapos sang stimulation gamit ang PMA (20 ng/ml) kag ionomycin (1 μg/ml) sa sulod sang 4 ka oras.
Sunda ang protocol sang manufacturer sa pag-isolate sang RNA gamit ang RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gamita ang QIAshredder (QIAGEN) sa pag-homogenize sang sample. Gamita ang high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) sa pag-synthesize sang complementary DNA (cDNA). Gamita ang TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) sa pag-isip sang ekspresyon sang gene (suno sa protocol sang manufacturer) gamit ang masunod nga mga probe: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755m1515S, 2012 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] kag Hs01010726_m1 (SLC22A2). Ang mga sample ginpadalagan sa StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sa MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) nga may MicroAmp optical film. Ang bisan ano nga Ct value nga magsobra sa 35 ginakabig nga labaw sa detection threshold kag ginamarkahan nga indi makita.
Himua ang ChIP subong sang ginlaragway na (58). Sa malip-ot nga pulong, ang mga selula gintratar sang formaldehyde (katapusan nga konsentrasyon 1.42%) kag gin-incubate sa temperatura sang kwarto sa sulod sang 10 minutos. Gamita ang gindugang nga swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl kag 0.1% NP-40) sa yelo sa sulod sang 10 minutos, dayon i-resuspend sa immunoprecipitation buffer suno sa ginlaragway (58 ). Ang sample dayon gin-sonicate sa masunod nga mga siklo: 10 ka siklo (20 1-segundo nga mga pulso) kag isa ka static nga oras nga 40 segundos. I-incubate ang ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) kag SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) nga mga antibodies upod ang sample sa 4°CC nga mag-uyog sa bug-os nga gab-i. I-incubate ang protein A beads (Thermo Fisher Scientific) upod sa sample sa 4°C nga may mahinay nga pag-uyog sa sulod sang 1 ka oras, dayon gamita ang chelex beads (Bio-Rad) sa pagpauswag sang DNA, kag gamita ang proteinase K (Thermo Fisher) para sa pagtunaw sang protina. Ang TNFα promoter natukiban paagi sa PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sa kabaliskaran, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp nga produkto). Ang mga laragway ginhimo sang Image Lab (Bio-Rad) kag gin-isip gamit ang ImageJ software.
Ang supernatant sang kultura sang selula gintipon suno sa ginlaragway sa ibabaw. Ang determinasyon ginhimo suno sa mga pamaagi sang manufacturer sang human TNFα ELISA kit (Invitrogen), human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) kag human IFN-γ ELISA kit (Abcam). Suno sa protocol sang manufacturer, ang supernatant gin-dilute sang 1:100 para makita ang TNFα kag IL-2, kag 1:3 para makita ang IFN-γ. Gamita ang EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) sa pagtakus sang absorbance sa 450 nm.
Ang PBMC ginseparar gikan sa mga produkto sang pagbulag sang leukocyte (STEMCELL Technologies) paagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Ang mga selula sang CD3 + gin-isolate gikan sa PBMC gamit ang CD3 beads (Miltenyi). Sa presensya ukon pagkawala sang MNA, ang mga selula sang CD3+ gin-aktibo gamit ang plate-bound CD3 (5μg/ml), soluble CD28 (3μg/ml) kag IL-2 (300 U/ml; Proleukin) sa sulod sang 3 ka adlaw. Pagkatapos sang 3 ka adlaw, ang mga selula gintipon kag ginhugasan sang 0.9% nga saline, kag ang pellet gin-snap frozen. Ang pag-isip sang selula ginhimo paagi sa flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) gamit ang 123count eBeads.
Kuhaa ang mga metabolite suno sa ginlaragway sa ibabaw. Ang uga nga extract gin-reconstitute sa konsentrasyon nga 4000 cell equivalents/μl. Analisaha ang sample paagi sa reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kag CORTECS T3 column (2.1×150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters). Polar mass spectrometer (6470, Agilent), sa diin ang electrospray ionization naga-operate sa positibo nga paagi. Ang mobile phase A 0.1% formic acid (sa H2O), ang mobile phase B 90% acetonitrile, 0.1% formic acid. Ang LC gradient amo ang 0 tubtob 2 ka minutos para sa 100% A, 2 tubtob 7.1 ka minutos para sa 99% B, kag 7.1 tubtob 8 ka minuto para sa 99% B. Dayon i-re-equilibrate ang haligi gamit ang mobile phase A sa flow rate nga 0.6 ml/min sa sulod sang 3 ka minuto. . Ang kadasigon sang pag-ilig 0.4ml/min, kag ang hulot sang haligi ginapainit sa 50°C. Gamita ang puro nga kemikal nga sulundan sang MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) sa pagtukod sang retention time (RT) kag pagbag-o (RT = 0.882 minutos, pagbag-o 1 = 137→94.1, pagbag-o 2 = 137→92 , Conversion = 17→77). Kon ang tanan nga tatlo ka mga pagbalhin nagakatabo sa husto nga oras sang paghupot, ang pagbalhin 1 ginagamit para sa pag-isip agud masiguro ang pagka-espesipiko. Ang standard curve sang MNA (Toronto Research Chemical Company) ginhimo paagi sa anom ka serial dilutions sang stock solution (1 mg/ml) agud makuha ang mga standards sang 0.1, 1.0, 10 kag 100 ng/ml kag 1.0 kag 10μg/ml nga likido. Ang limitasyon sa pagtukib amo ang 1 ng/ml, kag ang linear nga sabat yara sa tunga sang 10 ng/ml kag 10μg/ml. Ang tagsa ka indyeksion sang duha ka microliters sang sample kag standard ginagamit para sa pag-analisar sang LC/MS, kag ang isa ka mixed quality control sample ginapadalagan kada walo ka indyeksion agud masiguro ang kalig-on sang plataporma sang pag-analisar. Ang mga sabat sang MNA sang tanan nga mga sample sang selula nga ginbulong sang MNA yara sa sulod sang linear range sang assay. Ang pag-analisar sang datos ginhimo gamit ang MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent).
Ang ikaduha nga henerasyon sang αFR-CAR nga konstruksyon ginkuha gikan sa Song et al. (59). Sa malip-ot nga pulong, ang konstruksyon nagaunod sang masunod nga mga kaundan: CD8a leader sequence, human αFR-specific single-chain variable fragment, CD8a hinge kag transmembrane region, CD27 intracellular domain kag CD3z intracellular domain. Ang kompleto nga CAR sequence gin-synthesize sang GenScript, kag dayon gin-clone sa ikaduha nga henerasyon nga lentiviral expression vector sa ibabaw sang GFP expression cassette nga gingamit sa pag-ebalwar sang transduction efficiency.
Ang lentivirus ginahimo paagi sa transfection sang HEK293T cells [American Type Culture Collection (ATCC); ginpatubo sa Dulbecco's modified Eagle medium nga may 10% fetal bovine serum (FBS) kag 1% PenStrep, kag naggamit sang CAR-GFP vector kag Ang mga plasmid sa pagputos (psPAX2 kag pMD2.G, Addgene) nagagamit sang lipofection amine (Sigma-Aldrich). Ang virus-containing supernatant gintipon 48 kag 72 ka oras pagkatapos sang transfection, ginsala, kag ginkonsentrar paagi sa ultracentrifugation. Tipigi ang konsentrado nga viral supernatant sa -80°C tubtob sa transduction.
Ang PBMC ginapain gikan sa mapagros nga mga produkto sa pagbulag sang leukocyte sang donor (STEMCELL Technologies) paagi sa Ficoll gradient density centrifugation. Gamita ang positibo nga pagpili sang CD8 microbeads (Miltenyi) sa pag-isolate sang CD8+ cells gikan sa PBMC. Pukawon ang mga T cells gamit ang TransAct (Miltenyi) kag sa TexMACS medium [Miltenyi; gindugangan sang 3% nga heat-inactivated human serum, 1% PenStrep kag IL-2 (300 U/ml)]. Beinte-kwatro ka oras pagkatapos sang stimulation, ang mga T cells gin-transduce gamit ang lentivirus (10 μl concentrated virus supernatant kada 106 cells). 1 tubtob 3 ka adlaw pagkatapos sang transduction sa Cytek Aurora (sa FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ebalwaron ang GFP expression sang mga selula agud ipakita ang transduction efficiency nga indi magnubo sa 30% .
Ang mga selula sang CAR-T ginkultibar sa sulod sang 24 oras sa Immunocult (STEMCELL Technologies; gindugangan sang 1% PenStrep) sa idalom sang masunod nga mga kondisyon: wala ginbulong, ginbulong sang 250 μM adenosine ukon 10 mM MNA. Pagkatapos sang pretreatment, ang mga selula sang CAR-T ginhugasan gamit ang PBS kag gintingob sa 20,000 ka mga selula sang SK-OV-3 [ATCC; sa McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) nga gindugangan sang 10% FBS kag 1% PenStrep sa 10: Ang effector sa target nga ratio sang 1 ginpadaku sa triplicate sa gindugangan nga Immunocult medium. Ang mga selula sang SK-OV-3 kag mga selula sang SK-OV-3 nga gin-lyse gamit ang digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) gingamit bilang negatibo kag positibo nga mga kontrol, sa magkatuhay. Pagkatapos sang 24 ka oras nga co-cultivation, ang supernatant gintipon kag ang lactate dehydrogenase (LDH) gintakus suno sa mga instruksyon sang manufacturer (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Ang LDH supernatant gin-dilute 1:50 sa LDH buffer. Ang porsyento sang pagpatay gintakus gamit ang masunod nga pormula: porsyento sang pagpatay = porsyento sang pagtadlong / pinakamataas nga kadamuon sang pagpatay x 100%, sa diin porsyento sang pagtadlong = co-culture-T cells lamang, kag pinakamataas nga kadamuon sang pagpatay = positibo nga kontrol-negatibo nga kontrol.
Subong sang ginlaragway sa teksto ukon mga materyales kag mga pamaagi, gamita ang GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ukon R v3.6.0 para sa pag-analisar sang estadistika. Kon madamo nga mga sample ang nakolekta gikan sa pareho nga pasyente (subong sang ascites kag tumor), nagagamit kami sang isa ka pares nga t test ukon ginalakip ang pasyente bilang isa ka random nga epekto sa isa ka linear ukon generalized nga modelo kon nagakaigo. Para sa pag-analisar sang metabolomics, ang importansya nga pagtilaw ginahimo sa tatlo ka beses.
Para sa mga dugang nga materyales para sa sini nga artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Isa ini ka bukas nga artikulo nga ginapanagtag sa idalom sang mga termino sang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, nga nagapahanugot sang paggamit, pagpanagtag kag pagkopya sa bisan ano nga medium, basta ang katapusan nga paggamit indi para sa komersyal nga ganansya kag ang premis amo nga ang orihinal nga obra husto. Reperensya.
Pahibalo: Ginapangabay lang namon sa imo nga ihatag ang imo email address agud mahibaluan sang tawo nga imo ginarekomendar sa pahina nga luyag mo nga makita nila ang email kag indi ini spam. Indi kami magkuha sang bisan ano nga mga email address.
Ini nga pamangkot ginagamit sa pagtilaw kon ikaw isa ka bisita kag pagpugong sang awtomatiko nga pagsumiter sang spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R. Bellnis), Deraphnis, Deraldill. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA nagaamot sa pagpugong sang immune system sang T cells kag nagarepresentar sang isa ka potensyal nga target sang immunotherapy para sa pagbulong sang kanser sang tawo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R. Bellnis), Deraphnis, Deraldill. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
Ang MNA nagaamot sa pagpugong sang immune system sang T cells kag nagarepresentar sang isa ka potensyal nga target sang immunotherapy para sa pagbulong sang kanser sang tawo.
©2021 Asosasyon sang Amerika para sa Pag-uswag sang Siyensya. ang tanan nga mga kinamatarong gintigana. Ang AAAS isa ka partner sang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kag COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.