Ang pag-sort sang protina sa secretory pathway kinahanglanon para sa pagpadayon sang cell compartmentalization kag homeostasis. Magluwas sa pag-sort nga ginapatunga sang shell, ang papel sang mga lipid sa pag-sort sang kinesin sa proseso sang transportasyon sang sekreto isa ka madugay na nga panguna nga pamangkot nga wala pa masabat. Diri, nagahimo kami sang 3D simultaneous multicolor high-resolution real-time imaging agud pamatud-an sa vivo nga ang bag-o nga gin-synthesize nga glycosylphosphatidylinositol-immobilized proteins nga may tuman kalaba nga ceramide lipid moieties gina-cluster kag gina-classify sa specialized endoplasms Net exit site, nga tuhay sa mga protina nga ginagamit sang transmembrane. Dugang pa, ginapakita namon nga ang kalabaon sang kadena sang ceramide sa endoplasmic reticulum membrane importante gid para sa sini nga pagpili sang pag-sort. Ang amon pagtuon nagahatag sang una nga direkta nga ebidensya sa vivo sa pagklasipikar sang mga kargamento sang protina base sa kalabaon sang lipid chain sa mga selective export sites sa secretory pathway.
Sa mga selula sang eukaryotic, ang mga protina nga ginhimo sa endoplasmic reticulum (ER) gina-sort dayon sa tion sang transportasyon paagi sa secretory pathway para sa pagdul-ong sa ila nagakaigo nga destinasyon sang selula (1). Magluwas sa pag-sort nga ginapatunga sang coat, madugay na nga ginabanabana nga ang pila ka mga lipid mahimo man magserbe nga mga selective exit points paagi sa pag-cluster sa ila sa partikular nga mga domain sang membrane nga partikular nga mga protina (2-5). Apang, may yara gihapon sang kakulang sang direkta nga ebidensya sa vivo sa pagpamatuod sining posible nga mekanismo nga nakabase sa lipid. Agod masolbar ining panguna nga problema, gintun-an namon sa lebadura kon paano ang glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) gina-export sing tuhay gikan sa ER. Ang GPI-APs isa ka sahi sang mga protina sa ibabaw sang selula nga konektado sa lipid ( 6, 7). Ang GPI-AP isa ka ginatago nga protina nga nagatapik sa naguwa nga mga leaflet sang plasma membrane paagi sa glycolipid moiety (GPI anchor). Ginabaton nila ang mga angkla sang GPI bilang konserbatibo nga mga pagbag-o pagkatapos sang paglubad sa ER lumen (8). Pagkatapos sang pag-angot, ang GPI-AP nagaagi sa Golgi apparatus (5, 9) halin sa ER pakadto sa plasma membrane. Ang presensya sang mga angkla sang GPI nagatuga sang GPI-AP nga madala sing separado gikan sa mga protina nga ginatago sang transmembrane (lakip ang iban pa nga mga protina sang plasma membrane) sa secretory pathway (5, 9, 10). Sa mga selula sang lebadura, ang GPI-APs ginapain gikan sa iban nga mga ginatago nga mga protina sa endoplasmic reticulum, kag dayon ginaputos sa pinasahi nga mga vesicle nga ginaputos sang coat protein complex II (COPII) (6, 7). Ang mga determinante sini nga proseso sang klasipikasyon sa proseso sang pag-eksport sang ER indi maathag, apang ginabanabana nga ini nga mekanismo mahimo nga nagakinahanglan sang mga lipid, ilabi na ang pag-remodel sang istruktura sang lipid nga bahin sang GPI anchor (5, 8). Sa lebadura, ang GPI lipid remodeling nagasugod gilayon pagkatapos nga ang GPI mag-angot, kag sa madamo nga mga kaso, ini ang kabangdanan sang ceramide nga mag-angot sa 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). Ang C26 ceramide amo ang panguna nga ceramide nga ginahimo sang mga selula sang lebadura tubtob subong. Gina-synthesize ini sa ER kag ang kalabanan sini gina-export sa Golgi apparatus paagi sa COPII vesicles (13). Ang ER export sang GPI-AP partikular nga nagakinahanglan sang nagapadayon nga ceramide synthesis (14, 15), kag sa baylo, ang pagbaylo sang ceramide sa inositol phosphate ceramide (IPC) sa Golgi apparatus nagadepende sa GPI anchor synthesis (16). Ang mga pagtuon sa biophysical nga may artipisyal nga mga membrana nagpakita nga ang tuman kalaba nga acyl chain ceramides mahimo magtingob sa pagporma sang mga ordered domain nga may pinasahi nga pisikal nga mga kinaiya (17, 18). Ini nga mga datos nagadul-ong sa hypothesis nga ang C26 ceramide kag GPI-AP nga may C26 ceramide nagagamit sang ila pisikal nga mga kinaiya sa pagtingob sa mahipid nga mga rehiyon ukon mga rehiyon sa medyo magamo nga ER membrane lipid nga palibot. Ini ginabug-usan sang malip-ot kag unsaturated glycerolipids (C16:1 kag C18:1) (19, 20). Ini nga mga rehiyon pagapilion nga tutukan sa partikular nga mga ER exit sites (ERES), sa diin ang ceramide kag ceramide-based GPI-AP mahimo nga ma-co-transport sa Golgi sa pareho nga dedikado nga COPII vesicle (5).
Sa sini nga pagtuon, direkta namon nga gintestingan ining mekanismo nga nakabase sa lipid paagi sa paggamit sang super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), nga isa ka cutting-edge microscopy technique nga makadungan sa pag-obserbar sang mga protina nga may label nga fluorescent Ang tatlo ka kolor kag tatlo ka dimensional (3D) nga mga laragway may tuman kataas nga resolusyon kag madasig sa mga selula nga buhi (221).
Una namon nga gin-apply ang teknolohiya sang SCLIM agud dugang nga mahatagan kahulugan kon paano ang normal nga GPI-AP nga may C26 ceramide nga grupo gin-screen gikan sa mga protina nga gintago sang transmembrane pagkatapos maghalin sa ER sa S. cerevisiae. Agod ma-usisa ang klasipikasyon sang ER, naggamit kami sang isa ka sistema sang genetiko nga direkta nga maka-visualize sang bag-o nga gin-synthesize nga kargamento nga nagasulod sa ERES sa vivo (7, 23). Bilang kargamento, ginpili namon ang C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 nga may marka nga green fluorescent protein (GFP) kag transmembrane secreted protein Mid2 nga may marka nga near-infrared fluorescent protein (iRFP), nga lunsay nagapuntirya sa plasma membrane (24–26). Sa sec31-1 nga mutant nga sensitibo sa temperatura, ining duha ka kargamento ginapabutyag sa idalom sang isa ka galactose-inducible promoter kag isa ka constitutive ERES marker. Sa sobra nga temperatura (37°C), bangod ang sec31-1 mutation nagaapektar sa pag-obra sang COPII coat component nga Sec31 sa pagpugong sang COPII germination kag ER export, ang bag-o nga gin-synthesize nga kargamento nagatipon sa ER (23). Pagkatapos nga mabugnaw sa manubo nga temperatura (24°C), ang sec31-1 mutant cells nakabawi gikan sa secretory area, kag ang natipon nga bag-o nga sintetiko nga kargamento nagsugod sa pag-export gikan sa ER. Ang CLIM visualization nagpakita nga ang kalabanan sang bag-o nga gin-synthesize nga Gas1-GFP kag Mid2-iRFP natipon gihapon sa ER sang sec31-1 mutant cells pagkatapos sang paglumlom sa 37°C kag dayon ginpaguwa sa 24°C sa sulod sang 5 minutos (Figure 1). Sanglit ang Mid2-iRFP ginapanagtag sa bug-os nga ER membrane, kag ang Gas1-GFP ginakonsentrar kag ginatipon sa discontinuous ER membrane area, ang ila distribusyon tuhay gid (Figure 1, A to C kag Movie S1). Dugang pa, subong sang ginapakita sa Figure 1D, ang Gas1-GFP cluster wala sing Mid2-iRFP. Ini nga mga resulta nagapakita nga ang GPI-AP kag transmembrane nga mga protina ginseparar sa nagkalainlain nga mga rehiyon sang ER membrane sang temprano. Ang Gas1-GFP cluster yara sa tupad sang isa ka partikular nga ERES nga may marka nga mCherry's COPII coat protein Sec13 (Figure 1, E kag F, kag pelikula S1) (23).
ang mga selula sang sec31-1 nagapabutyag sang mga sekreto nga ginatuga sang galactose, ang isa ka malaba nga kadena sang acyl (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berde) kag ang transmembrane nga protina nga Mid2-iRFP (TMP, asul) kag ini nga Constructive ERES nga nagamarka sang Sec13-mCherry (E) gin-incubate sa 30°C minutos, ginsaylo sa 24°C, kag gin-imahe sang SCLIM 5 minutos sang ulihi. (A tubtob C) nagapakita sang isa ka tiglawas nga gintingob ukon isa ka 2D nga laragway sang isa ka eroplano (A), isa ka 2D nga laragway sang projection sang 10 z-sections (B) ukon isa ka 3D cell hemisphere nga laragway sang kargamento kag ERES markers (C). Scale bar 1μm (A kag B). Ang yunit sang timbangan 0.551μm (C). Ang Gas1-GFP natukiban sa mga discrete ER regions ukon clusters, samtang ang Mid2-iRFP natukiban kag ginpanagtag sa bug-os nga ER membrane (C). (D) Ang graph nagapakita sang relatibo nga intensidad sang fluorescence sang Gas1-GFP kag Mid2-iRFP sa Gas1-GFP cluster sa puti nga linya sang pana (wala). AU, arbitraryo nga yunit. (E kag F) nagarepresentar sang 3D nga laragway nga nagatingob sang mga balaklon kag marka sang ERES. Ang mga cluster sang Gas1-GFP natukiban malapit sa partikular nga ERES. Ang yunit sang timbangan 0.551μm. (F) Ang puti nga solido nga pana nagamarka sang Gas1-GFP cluster nga may kaangtanan sa ERES. Ang tunga kag tuo nga mga panel nagapakita sang gintingob nga ginpadaku nga 3D nga laragway kag isa ka gintuyok nga pagtan-aw sang napili nga Gas1-GFP cluster.
Ang suod nga kaangtanan sa espasyo sa tunga sang Gas1-GFP cluster kag isa ka partikular nga ERES nagapakita nga ang Gas1-GFP mahimo makasulod sa selective ERES, nga tuhay sa selectivity nga ginagamit sang Mid2-iRFP sa pagbiya sa ER. Agod masabat ini nga posibilidad, gin-quantify namon ang ERES ratio para sa isa ukon duha lamang ka mga balaklon (Figure 2, A to C). Nakita namon nga ang kalabanan nga ERES (70%) nagaunod lamang sang isa ka sahi sang kargamento. Ang laragway sa idalom sang Figure 2C nagapakita sang duha ka tipikal nga halimbawa sang ERES nga may Gas1-GFP lamang (Figure 1) ukon Mid2-iRFP lamang (Figure 2). Sa kabaliskaran, ginabanta nga 20% sang ERES ang nagaunod sang duha ka kargamento nga naga-overlap sa pareho nga lugar. Nakita nga ang pila ka ERES (10%) nagaunod sang duha ka sahi sang kargamento, apang sila nahamulag sa maathag nga magkatuhay nga mga lugar. Gani, ini nga pag-analisar sang estadistika nagapakita nga pagkatapos nga ang ER gin-eksport, ang GPI-AP Gas1-GFP kag ang transmembrane cargo Mid2-iRFP gintunga sa lainlain nga ERES (Figure 2D). Ini nga pagkaepisyente sa pag-sort nagahisanto gid sa nagligad nga pag-analisar sang biokemikal (6) kag determinasyon sang morpolohiya (7). Mahimo man naton maobserbahan ang pamatasan sang gin-quarantine nga kargamento nga nagasulod sa ERES (Figure 2E kag Movie S2). Ang Figure 2E nagapakita nga ang gamay nga bahin lamang sang Gas1-GFP (panel 3) ukon Mid2-iRFP (panel 4) ang nagasulod sa ERES gikan sa isa ka kilid kag natakpan sa isa ka separado nga lugar. Ang Panel 5 sang Figure 2E nagapakita nga ang Gas1-GFP kag Mid2-iRFP kon kaisa makita sa pareho nga ERES, apang nagasulod sila gikan sa lainlain nga mga kilid kag nagakonsentrar sa separado nga mga rehiyon nga mahimo nagarepresentar sang lainlain nga mga COPII vesicles. Ginkumpirma man namon nga ang naobserbahan nga pagbulag kag klasipikasyon sang C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 bilang selective ERES espesipiko bangod ang isa pa ka transmembrane secretion cargo, ang GFP-tagged plasma membrane protein Axl2 (27 ), nga nagapakita sang kaanggid nga pamatasan sa Mid2-iRFP. (Laragway S1 kag Pelikula S3). Ang bag-o nga gin-synthesize nga Axl2-GFP ginapanagtag paagi sa ER membrane pareho sang Mid2-iRFP (Figure S1, A kag B), kag gina-co-localize upod sa Mid2-iRFP sa kalabanan nga ERES (Figure S1, B to D). Ang mga panel 1 kag 2 sang Figure 1. Ang S1C nagapakita sang duha ka tipikal nga halimbawa sang ERES sa diin ang duha ka transmembrane cargoes naga-overlap. Sa sini nga mga kaso, ang duha ka mga butang nagasulod sa ERES sing tingob (Figure S1E, Panel 3 kag Movie S3).
Ang sec31-1 nga mga selula nga nagapabutyag sang galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) kag Mid2-iRFP (TMP, asul) kag constitutive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) ginbutang sa 37 Pagkatapos sang pag-incubate sa sulod sang 30 minutos sa °C, magsaylo sa imahe kag pag-block sa sekreto upod ang SCLIM pagkatapos sang 20 minutos. (A tubtob C) Representatibo nga 2D nga mga laragway sang projection (A; scale bar, 1μm) ukon 3D nga mga laragway sang hemisphere sang selula (B kag C; scale unit, 0.456μm) sang kargamento kag 10 ka z-sections nga ginmarkahan sang ERES. Ang mas manubo nga panel sa (B) kag ang panel sa (C) nagapakita sang mga ginproseso nga mga laragway sa pagpakita lamang sang mga butang nga yara sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (gray) kag Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Bukas nga pana: Ang ERES nagadala lamang sang isa ka kargamento (1 tubtob 4). Grey arrow: Ang ERES nagaunod sang segregated cargo (5). Puti nga solido nga pana: ERES nga nagaunod sang co-located nga kargamento. Sa idalom: Ang napili nga isa ka ERES nagaunod lamang sang Gas1-GFP (1) ukon Mid2-iRFP (2). Scale bar, 100 nm. (D) Pag-isip sang photomicrograph nga ginlaragway sa (C). Ang average nga porsyento sang ERES nga nagaunod sang isa lang ka kargamento (Gas1-GFP ukon Mid2-iRFP), ginseparar nga kargamento kag nagatungtong nga kargamento. Sa tatlo ka independiente nga mga eksperimento, n=432 sa 54 ka mga selula. Error bar = SD. Duha ka ikog nga wala’y pares nga t test. *** P = 0.0002. (E) 3D nga laragway sang pinili nga ERES sang gin-quarantine nga kargamento nga may marka nga (C). Ang Gas1-GFP (berde) (3) ukon Mid2-iRFP (asul) (4) nagasulod sa ERES (magenta) gikan sa isa ka kilid kag ginalimitahan sa isa ka gamay nga lugar sa sulod sang ERES. Kon kaisa, ang duha ka sahi sang kargamento nagasulod sa pareho nga ERES (5) gikan sa pareho nga kilid kag ginakulong sa isa ka naligwin nga lugar sa sulod sang ERES. Scale bar, 100 nm.
Masunod, gintestingan namon ang isa ka hypothesis nga ang malaba nga acyl chain ceramide (C26) nga yara sa ER membrane nagamaneho sang partikular nga pag-cluster kag pag-sort sang Gas1 sa selective ERES. Sa sini nga katuyuan, naggamit kami sang ginbag-o nga yeast strain GhLag1, sa diin ang duha ka endogenous ceramide synthases Lag1 kag Lac1 ginbuslan sang GhLag1 (ang Lag1 homolog sang gapas), nga nagresulta sa isa ka yeast strain nga may cell membrane Ceramide strain nga mas malip-ot sangsa wild type (Figure 3A) (28). Ang pag-analisar sang mass spectrometry (MS) nagpakita nga sa wild-type strains, 95% sang kabug-usan nga ceramide ang tuman kalaba (C26) chain ceramide, samtang sa GhLag1, 85% sang ceramide ang tuman kalaba (C18 kag C16). ), 2% lang sang ceramide ang tuman kalaba (C26) nga kadena nga ceramide. Bisan pa ang C18 kag C16 ceramides amo ang panguna nga mga ceramides nga nakit-an sa GhLag1 membrane tubtob subong, ang pag-analisar sang MS nagkumpirma man nga ang GPI anchor sang Gas1-GFP nga ginpabutyag sa GhLag1 strain nagaunod sang C26 ceramide, nga kaanggid sa wild-type lipids. Ang kalidad pareho (Fig. 3A) (26). Gani, nagakahulugan ini nga ang ceramide remodeling enzyme Cwh43 mapilion gid para sa C26 ceramide, subong sang ginapakita sa Figure 26, mas gusto sini nga ginalakip ang GPI anchor gikan sa gamay nga kadamuon sang C26 ceramide sa GhLag1 strain. S2 (29). Bisan pa, ang cell membrane sang GhLag1 nagaunod lamang sang C18-C16 ceramide, samtang ang Gas1-GFP may yara gihapon sang C26 ceramide. Ini nga kamatuoran nagahimo sini nga strain nga isa ka maayo nga gamit sa partikular nga paglubad sang problema sang kalabaon sang acyl chain sang membrane ceramide sa ER. Ang hypothetical nga papel sang klase kag pag-sort. Dayon, una namon nga gintun-an ang ikasarang sang C26 Gas1-GFP nga magtipon sa mga cluster sa GhLag1 nga may temperatura-sensitibo nga mutant allele sang sec31-1 paagi sa naandan nga fluorescence microscopy, sa diin ang malaba (C18-C16) nga kadena lamang ang nagaluntad sa ER membrane Ceramide (Fig. 3). Naobserbahan namon nga sa sec31-1, ang kalabanan sang Gas1-GFP natipon sa mga cluster, samtang ang Gas1-GFP sa sec31-1 GhLag1 nga may malaba (C18-C16) nga malaba nga ceramide ER membrane sa panguna wala ma-cluster kag ginpanagtag sa Sa bug-os nga ER membrane. Para mangin eksakto, bangod ang C26 ceramide-based clustering suod nga may kaangtanan sa partikular nga ERES (Figure 1), masunod namon nga gin-usisa kon bala ini nga proseso mahimo man maglakip sang function sang ER export protein mechanism. Ang GPI-AP nagagamit sang isa ka pinasahi nga sistema sang COPII para sa ER export, nga aktibo nga ginakontrol sang Ted1′s structural remodeling sang glycan nga bahin sang GPI anchor (30, 31). Ang recombinant GPI-glycan dayon ginakilala sang transmembrane cargo receptor p24 complex, nga sa baylo nagapili sang Lst1, nga isa ka partikular nga isoform sang mayor nga COPII cargo binding subunit Sec24, nga nagaporma sang GPI-AP-rich COPII Vesicles are necessary (31-33). Gani, naghimo kami sang isa ka doble nga mutant nga nagtingob sang pagdula sining mga single proteins (ang p24 complex component Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 kag ang partikular nga COPII subunit Lst1) upod sa sec31-1 mutant strain, kag gintun-an sila Posible bala nga magporma sang Gas1-Gluster GFP (Figure 3FP). Naobserbahan namon nga sa sec31-1emp24Δ kag sec31-1ted1Δ, ang Gas1-GFP panguna nga wala ginatipon kag ginapanagtag sa bug-os nga ER membrane, subong sang nakita na sa sec31-1 GhLag1, samtang sa sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Pareho sang sec31-1-1. Ini nga mga resulta nagapakita nga magluwas sa presensya sang C26 ceramide sa ER membrane, ang pag-cluster sang Gas1-GFP kinahanglan man nga magbugkos sa p24 complex, kag wala nagakinahanglan sang partikular nga Lst1 recruitment. Dayon, gin-usisa namon ang posibilidad nga ang kalabaon sang kadena sang ceramide sa ER membrane maka-regulate sang pagbugkos sang Gas1-GFP sa p24. Apang, nakita namon nga ang presensya sang C18-C16 ceramide sa membrane wala nagaapektar sa GPI-glycans nga gintukod liwat sang p24 complex (Mga Pigura S3 kag S4, A kag B) ukon pagbugkos sa GPI-AP kag pag-export sang GPI-AP. abilidad. Recruit ang COPII subtype Lst1 (Figure S4C). Gani, ang C26 ceramide-dependent clustering wala nagakinahanglan sang mga interaksiyon sang protina sa nagkalainlain nga mga mekanismo sang protina sa pag-export sang ER, apang nagasuporta sang isa ka alternatibo nga mekanismo sang pag-sort nga ginatuytuyan sang kalabaon sang lipid. Dayon, gin-analisar namon kon bala ang kalabaon sang kadena sang ceramide acyl sa ER membrane importante para sa epektibo nga klasipikasyon sang Gas1-GFP bilang selective ERES. Sanglit ang Gas1 sa GhLag1 strain nga may short-chain ceramide nagahalin sa ER kag nagasulod sa plasma membrane (Figure S5), nagapati kami nga kon ang pag-sort ginatuytuyan sang kalabaon sang ceramide acyl chain, ang Gas1 sa GhLag1 strain mahimo nga ma-redirect kag ma-cross. ERES nga mga butang nga may parehas nga lamad.
(A) Ang cell membrane sang GhLag1 nagaunod sang mas malip-ot nga C18-C16 ceramides, samtang ang GPI anchor sang Gas1-GFP may yara gihapon sang pareho nga C26 IPC subong sang wild-type cells. Sa ibabaw: pag-analisar sang kalabaon sang kadena sang acyl sang ceramide sa cell membrane sang wild-type (Wt) kag GhLag1p strains paagi sa mass spectrometry (MS). Ang datos nagarepresentar sang porsyento sang kabug-usan nga ceramide. Ang aberids sa tulo ka independente nga mga eksperimento. Error bar = SD. Duha ka ikog nga wala’y pares nga t test. **** P ＜0.0001. Bottom panel: MS analysis sang acyl chain length sang IPC nga yara sa Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor nga ginpabutyag sa wild-type kag GhLag1p strains. Ang datos nagarepresentar sang porsyento sang kabug-usan nga signal sang IPC. Average sang lima ka independiente nga mga eksperimento. Error bar = SD. Duha ka ikog nga wala’y pares nga t test. ns, indi importante. P = 0.9134. (B) Ang mga micrograph sang fluorescence sang sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ kag sec31-1lst1Δ nga mga selula nga nagapahayag sang galactose-induced Gas1-GFP gin-incubate sa 37°C sa sulod sang 30°C sa sulod sang 30 minutos kag ginpaidalom sa fluoresce mikroskopyo pagkatapos sang 24°C. Puti nga pana: ER Gas1-GFP cluster. Bukas nga pana: Ang wala ma-cluster nga Gas1-GFP ginapanagtag sa bug-os nga ER membrane, nga nagapakita sang ER nga kinaiya sang nuclear ring staining. Scale bar, 5μm. (C) Pag-isip sang photomicrograph nga ginlaragway sa (B). Ang average nga porsyento sang mga selula nga may punctate Gas1-GFP nga istruktura. Sa tatlo ka independiente nga mga eksperimento, n≥300 ka mga selula. Error bar = SD. Duha ka ikog nga wala’y pares nga t test. **** P ＜0.0001.
Agod direkta nga masolbar ini nga problema, ginhimo namon ang SCLIM visualization sang Gas1-GFP kag Mid2-iRFP sa GhLag1 nga may sec31-1 temperature-sensitive mutant allele (Figure 4 kag Movie S4). Pagkatapos nga ang ER ginhuptan sa 37°C kag pagkatapos nga ginpaguwa sa 24°C, ang kalabanan sang bag-o nga gin-synthesize nga Gas1-GFP wala gin-cluster kag ginpanagtag sa bug-os nga ER membrane, subong sang naobserbahan sang naandan nga mga mikroskopyo (Figure 4, A kag B ). Dugang pa, ang daku nga porsyento sang ERES (67%) nagalakip sang duha ka sahi sang kargamento nga nahamtang sing tingob sa sini (Figure 4D). Ang mga panel 1 kag 2 sang Figure 4C nagapakita sang duha ka tipikal nga halimbawa sang ERES nga may nagatungtong nga Gas1-GFP kag Mid2-GFP. Dugang pa, ang duha ka mga butang ginrekrut sa pareho nga ERES (Figure 4E, panel 3 kag pelikula S4). Gani, ang amon mga resulta nagapakita nga ang kalabaon sang ceramide acyl chain sa ER membrane isa ka importante nga determinante sang ER protein aggregation kag classification.
Sec31-1 GhLag1 cells nga nagapahayag sang galactose-induced secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) kag Mid2-iRFP (TMP, asul) kag constitutive ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) Incubate sa 37°C. Padayon sa sulod sang 30 minutos, ihulog sa 24°C agud magpaguwa sang mga sekreto, kag mag-imahe gamit ang SCLIM pagkatapos sang 20 minutos. (A tubtob C) Representatibo nga 2D nga mga laragway sang projection (A; scale bar, 1μm) ukon 3D nga mga laragway sang hemisphere sang selula (B kag C; scale unit, 0.45μm) sang 10 ka z-sections nga ginmarkahan sang kargamento kag ERES. Ang mas manubo nga panel sa (B) kag ang panel sa (C) nagapakita sang mga ginproseso nga mga laragway sa pagpakita lamang sang mga butang nga yara sa ERES (magenta) [Gas1-GFP (gray) kag Mid2-iRFP (light blue)]. (C) Puti nga puno nga pana: ERES, mga butang nga naga-overlap. Bukas nga pana: Ang ERES nagaunod lamang sang isa ka butang. Lower panel: Ang napili nga ERES may naga-overlap nga mga balaklon (1 kag 2) nga ginmarkahan sa (C). Scale bar, 100 nm. (D) Pag-isip sang photomicrograph nga ginlaragway sa (C). Sa sec31-1 kag sec31-1 GhLag1 units, isa lang ka kargamento (Gas1-GFP ukon Mid2-iRFP) ang nalakip, kag ang average nga porsyento sang ERES para sa isolated cargo kag overlapping cargo. Sa tatlo ka independiente nga mga eksperimento, n = 432 sa 54 ka mga selula (sec31-1) kag n = 430 sa 47 ka mga selula (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Duha ka ikog nga wala’y pares nga t test. *** P = 0.0002 (sec31-1) kag ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D nga laragway sang napili nga ERES nga may nagatungtong nga kargamento (3) nga ginmarkahan sa (C). Ang Gas1-GFP (berde) kag Mid2-iRFP (asul) nagapalapit sa ERES (magenta) gikan sa pareho nga kilid kag nagapabilin sa pareho nga ERES nga ginadumilian nga lugar. Scale bar, 100 nm.
Ini nga pagtuon nagahatag sang direkta nga ebidensya sa vivo nga ang mga kargamento sang protina nga nakabase sa lipid ginaklasipikar sa mga selective export sites sa secretory pathway, kag nagapakita sang importansya sang acyl chain length para sa classification selectivity. Gamit ang isa ka gamhanan kag pinakabag-o nga teknik sa mikroskopyo nga ginatawag SCLIM, ginpakita namon ang bag-o nga gin-synthesize nga Gas1-GFP (isa ka mayor nga plasma membrane GPI-AP nga may tuman kalaba nga acyl chain (C26) ceramide lipid portion) sa lebadura) Ang mga rehiyon nga natipon sa discrete ERs may kaangtanan sa partikular nga ERES, samtang ang mga transmembrane nga protina ginapanagtag paagi sa ERRES nga membrane (Figure 1). Dugang pa, ining duha ka sahi sang mga balaklon nagasulod sa lainlain nga ERES sing mapilion (Figure 2). Ang kalabaon sang acyl chain sang cellular ceramide sa membrane ginabuhinan halin sa C26 pakadto sa C18-C16, ang Gas1-GFP cluster ginatublag sa discrete ER region, kag ang Gas1-GFP gina-reroute sa pagbiya sa ER upod ang transmembrane protein paagi sa amo man nga ERES (Figure 3 kag Figure 3). 4).
Bisan pa ang GPI-AP nagagamit sang isa ka pinasahi nga mekanismo sang protina sa pagguwa sa ER, nakita namon nga ang C26 ceramide-dependent separation wala nagasalig sa mga interaksiyon sang protina nga mahimo magdul-ong sa espesyalisasyon sang ERES (Mga Pigura S4 kag S5). Sa baylo, ang amon mga natukiban nagasuporta sa isa ka alternatibo nga mekanismo sa klasipikasyon nga ginatuytuyan sang pagtipon sang protina nga nakabase sa lipid kag ang masunod nga pagdula sang iban nga mga kargamento. Ang amon mga obserbasyon nagapakita nga ang Gas1-GFP nga rehiyon ukon cluster nga may kaangtanan sa isa ka partikular nga ERES kulang sa transmembrane secreted protein Mid2-iRFP, nga nagapakita nga ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster magapadali sang ila pagsulod sa nagakaigo nga ERES, kag sa amo man nga tion, indi maglakip sang transmembrane Ang mga sekreto nagasulod sa sini nga partikular (Figures 1 kag RES ERES). Sa kabaliskaran, ang presensya sang C18-C16 ceramides sa ER membrane wala nagatuga sang GPI-AP nga magporma sang mga rehiyon ukon mga cluster, gani wala nila ginadula ukon ginabuslan ang mga protina nga ginatago sang transmembrane sa pareho nga ERES (Mga Pigura 3 kag 4). . Gani, ginaduso namon nga ang C26 ceramide nagaduso sang pagbulagay kag pagklasipikar paagi sa pagpadali sang pagtipon sang mga protina nga naangot sa partikular nga ERES.
Paano matigayon ining C26 ceramide-dependent clustering sa isa ka partikular nga ER area? Ang huyog sang membrane ceramide nga magbulag sa kilid mahimo nga mangin kabangdanan sang GPI-AP kag C26 ceramide nga magporma sang magagmay kag gilayon nga na-order nga mga lipid sa mas iregular nga lipid nga palibot sang ER membrane nga nagaunod sang mas malip-ot kag unsaturated glycerolipids. Mga kalidad nga mga hugpong (17, 18). Ining magagmay nga temporaryo nga mga hugpong mahimo nga dugang nga magtingob sa mas dalagku, mas malig-on nga mga hugpong pagkatapos sang paghigot sa p24 complex (34). Nahisuno sa sini, ginpakita namon nga ang C26 Gas1-GFP kinahanglan nga makig-angot sa p24 complex sa pagporma sang mas dalagku nga makita nga mga hugpong (Figure 3). Ang p24 complex isa ka heterozygous oligomer nga ginabug-usan sang apat ka nagkalainlain nga p24 transmembrane proteins sa lebadura (35), nga nagahatag sang multivalent binding, nga mahimo magdul-ong sa cross-linking sang magagmay nga GPI-AP clusters, sa amo nagahimo sang mas daku nga Stable cluster (34). Ang interaksiyon sa tunga sang mga ectodomain sang protina sang GPI-APs mahimo man makaamot sa ila pagtipon, subong sang ginapakita sa tion sang ila transportasyon sang Golgi sa mga selula sang epithelial nga polarized sang mammalian (36). Apang, kon ang C18-C16 ceramide yara sa ER membrane, kon ang p24 complex nagaangot sa Gas1-GFP, ang dalagku nga separado nga mga hugpong indi maporma. Ang nagapaidalom nga mekanismo mahimo nga nagadepende sa partikular nga pisikal kag kemikal nga mga kinaiya sang malaba nga acyl chain ceramide. Ang mga pagtuon sa biophysical sang artipisyal nga mga membrana nagapakita nga bisan pa nga ang malaba (C24) kag malip-ot (C18-C16) nga mga acyl chain ceramides mahimo nga makatuga sang pagbulagay sang hugna, ang malaba nga acyl chain ceramides (C24) lamang ang makapasanyog sang mataas nga Curvature kag film bending sa pag-reshape sang pelikula. Paagi sa mutual reference (17, 37, 38). Ginpakita nga ang transmembrane helix sang TMED2, ang human homologue sang Emp24, nagapili nga nagapakig-angot sa C18 ceramide-based sphingomyelin sa cytoplasmic lobules (39). Gamit ang mga simulation sang molecular dynamics (MD), nakita namon nga ang C18 kag C26 ceramides nagatipon sa palibot sang cytoplasmic lobules sang Emp24 transmembrane helix, kag may pareho sila nga mga pagpasulabi (Figure S6). Dapat talupangdon nga nagapakita ini nga ang transmembrane helix sang Emp24 mahimo magdul-ong sa asymmetric distribution sang mga lipid sa membrane. Isa ini ka bag-o nga resulta base sa mga selula sang mamalya. Ang kaanggid nga mga simulation sang MD nagapakita man sang presensya sang mga lipid sang ether (40) . Gani, ginabanabana namon nga ang C26 ceramide sa duha ka lobules sang ER26 lokal nga ginpauswag. Kon ang GPI-AP sa luminal lobules direkta nga nagabugkos sa multivalent p24 kag ang pagtipon sang C26 ceramide sa palibot sang p24 sa cytoplasmic lobules, mahimo ini magpasanyog sang kaupod nga Protein aggregation kag membrane curvature ginatuga paagi sa mga tudlo (41), nga nagatuga sang GPI-AP nga magbulag sa mga discrete nga mga rehiyon nga malapit sa ERES, nga nagapabor man sa mataas nga kurbada nga mga rehiyon ang ER membrane (42). Ang mga nauna nga report nagsuporta sa ginproponer nga mekanismo (43, 44). Ang multivalent binding sang oligolectins, pathogens ukon antibodies sa ceramide-based glycosphingolipids (GSL) sa plasma membrane naga-trigger sang daku nga GSL aggregation, nagapauswag sang phase separation kag nagatuga sang membrane deformation kag internalization (44). Iwabuchi kag iban pa. (43) Nakita nga sa presensya sang malaba (C24) apang indi malip-ot (C16) nga mga kadena sang acyl, ang multivalent ligand nga nabugkos sa GSL lactosylceramide nag-induce sang pagporma sang dalagku nga mga clusters kag membrane invagination, kag ang cytoplasm Lyn-mediated signal transduction sa mga leaflets gina-interitatate sang isa ka neutrophils chains sa mga mag-asawa.
Sa mga mammalian polarized epithelial cells, ang konsentrasyon sang anti-Golgi network (TGN) sa lebel sang apical plasma membrane nagakontrol sang pagbulag kag pag-sort sang GPI-AP (10, 45). Ini nga pagtipon ginatuytuyan sang GPI-AP oligomerization (36), apang mahimo man ini magdepende sa kalabaon sang kadena sang ceramide nga makita naton sa lebadura. Bisan pa ang mammalian GPI-AP may yara sang ether lipid-based anchor, kag ang iya kemikal nga istruktura tuhay gid sa tuman kalaba nga acyl chain ceramide, ang isa ka pagtuon sining karon lang nakakita nga ang duha ka lipid may pareho nga pisikal kag kemikal nga mga kinaiya kag pag-obra (40). Gani, ang ether lipid nga bahin sa mga selula sang mamalya mahimo nga kaanggid sa C26 ceramide sa lebadura, kag ang papel sini amo ang pag-upod sa long-chain ceramide sa membrane sa pagpasanyog sang GPI-AP aggregation kag pag-sort. Bisan pa nga ini nga posibilidad kinahanglan pa nga testingan sing direkta, ang mga nauna nga natukiban nagasakdag nga ang pagdala sang malaba nga kadena sang acyl ceramide sa lawas sang Golgi wala ginahimo sang mga protina sa pagbalhin sang cytoplasmic, kundi nagadepende sa pagtingob sang mga angkla sang GPI pareho sang lebadura. Gani, ang ebolusyonaryo nga konserbatibo nga mekanismo daw makahimo sa pagpili nga co-transport sang tuman kalawig nga acyl chain ceramide kag GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) sa pareho nga transport vesicle.
Sa lebadura kag mammalian polarized epithelial cell systems, ang GPI-AP aggregation kag pagbulag gikan sa iban nga mga protina sang plasma membrane tanan nagakatabo antes makalab-ot sa ibabaw sang selula. Paladino et al. (48) nakita nga sa TGN sang mammalian polarized epithelial cells, ang GPI-AP clustering indi lamang kinahanglanon para sa selective classification sang GPI-APs sa apical plasma membrane, kundi naga-regulate man sang clustering organization sang GPI-APs kag ang Biological activity sini. Nawong sang selula. Sa lebadura, ini nga pagtuon nagpakita nga ang C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster sa ER maka-regulate sang organisasyon sang cluster kag functional nga aktibidad sang GPI-AP sa plasma membrane (24, 49). Nahisanto sa sini nga modelo, ang mga selula sang GhLag1 alerdyik sa mga inhibitor sang GPI ukon mga droga nga nagaapektar sa integridad sang dingding sang selula (28), kag ang kinahanglanon para sa functional Gas1-GFP clusters (49) sang tip ceramide nga ginproyekto sa pag-asawahay sang mga selula sang lebadura nagapakita sang G Posible nga mga resulta sa pisyolohiya sang mga selula sang hLag1. GPI-AP nga sayop. Apang, ang dugang nga pagtilaw kon bala ang functional nga organisasyon sang ibabaw sang selula ginprograma gikan sa ER paagi sa isa ka pamaagi sa pag-sort base sa kalabaon sang lipid amo ang subject sang amon palaabuton nga pagpanalawsaw.
Ang mga strain sang Saccharomyces cerevisiae nga gingamit sa sini nga buluhaton nalista sa Table S1. Ang MMY1583 kag MMY1635 nga mga strain sang SCLIM para sa live cell imaging ginhimo sa background sang W303. Ining mga strain nga nagapahayag sang Sec13-mCherry nga may fluorescent protein tag ginhimo gamit ang polymerase chain reaction (PCR)-based nga pamaagi nga may pFA6a plasmid bilang template (23). Ang strain nga nagapahayag sang Mid2-iRFP nga may marka nga fluorescent protein sa idalom sang kontrol sang GAL1 promoter gintukod subong sang masunod. PCR amplification sang iRFP-KanMx sequence gikan sa pKTiRFP-KAN vector (regalo ni E. O'Shea, Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) Kag ginsulod sa Cterminus-endogenous sang Midgeneus. Pagkatapos nga ang Mid2-iRFP genome sequence ginpadaku kag gin-clone sa GAL1 promoter, gin-integrate ini sa Not I-Sac I site sang integration plasmid pRS306. Ang resulta nga plasmid pRGS7 gin-linearize sa Pst I agud mag-integrate sa URA3 locus.
Ang Gas1-GFP fusion gene ginapabutyag sa idalom sang pagkontrol sang GAL1 promoter sa centromere (CEN) plasmid, nga gintukod subong sang masunod. Ang Gas1-GFP sequence ginpadaku paagi sa PCR gikan sa pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (regalo ni L. Popolo) kag gin-clone sa Xma I–Xho I site sang CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (regalo sang C) . Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Ang resulta nga plasmid ginhingalanan nga pRGS6. Ang Axl2-GFP fusion gene ginapabutyag man sa idalom sang kontrol sang GAL1 promoter sang pBEVY-GL LEU2 vector, kag ang pagtukod sini amo ang masunod. Ang Axl2-GFP sequence ginpadaku gikan sa pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) paagi sa PCR, kag gin-clone sa Bam HI-Pst I site sang pBEVY-GL LEU2 vector. Ang resulta nga plasmid ginhingalanan nga pRGS12. Ang pagkasunod-sunod sang mga oligonucleotide nga gingamit sa sini nga pagtuon nalista sa Table S2.
Ang strain gindugangan sang 0.2% adenine kag 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] rich yeast extract protein p (YP) medium (1 % Yeast extract kag 2% protein ept). (YPR)] ukon 2% galactose [YP-galactose (YPG)] bilang isa ka ginahalinan sang carbon, ukon sa isa ka sintetiko nga minimal nga medium (0.15% yeast nitrogen base kag 0.5% ammonium sulfate) sa pagdugang sang nagakaigo nga mga amino acid kag mga base nga kinahanglanon para sa nutrisyon, Kag nagaunod sang 2% glucose (2% glucose glucose) ukon minimal medium galactose (synthetic galactose minimal medium) bilang isa ka ginahalinan sang carbon.
Para sa real-time imaging, ang mga sec31-1 mutant cells nga sensitibo sa temperatura nga nagapahayag sang construct sa idalom sang GAL1 promoter ginpatubo sa YPR medium sa 24°C sa bug-os nga gab-i tubtob sa tungatunga nga log phase. Pagkatapos sang induction sa YPG sa 24°C sa sulod sang 1 ka oras, ang mga selula gin-incubate sa SG sa 37°C sa sulod sang 30 minutos, kag dayon ginsaylo sa 24°C agud magguwa gikan sa secretion block. Ang Concanavalin A gingamit sa pag-ayo sang mga selula sa isa ka bildo nga slide kag gin-imahe sang SCLIM. Ang SCLIM isa ka kombinasyon sang Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope kag UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), high-speed kag high-signal-to-noise ratio rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), custom spectrometer, kag intensivo nga sistema sang cotomofier (Hamamatsu Photonics) makahatag sang magnifying lens system nga may katapusan nga magnification nga ×266.7 kag isa ka charge-coupled device camera nga nagapadamo sang mga electron (Hamamatsu Photonics) (21). Ang pagkuha sang laragway ginahimo paagi sa custom software (Yokogawa Electric). Para sa 3D nga mga laragway, naggamit kami sang isa ka custom-made piezoelectric actuator sa pagtiyog sang objective lens sing patindog, kag gintipon ang mga optical parts nga 100 nm ang kalayuon sa isa ka stack. Ang Z-stack nga laragway ginabaylo sa 3D voxel data, kag ang teoretikal nga point spread function nga ginagamit para sa rotating disc confocal microscope ginagamit para sa deconvolution processing sang Volocity software (PerkinElmer). Paagi sa paggamit sang Volocity software sa awtomatiko nga threshold para sa co-location analysis, ang ERES lakip ang kargamento gintakus. Ang pag-analisar sang line scan ginhimo gamit ang MetaMorph software (Molecular Devices).
Gamita ang GraphPad Prism software sa pagdeterminar sang statistical significance. Para sa two-tailed Student's t-test kag ang ordinaryo nga one-way analysis of variance (ANOVA) test, ang mga kinatuhayan sa tunga sang mga grupo ginakabig nga may daku nga epekto sa P <0.05 (*).
Para sa fluorescence microscopy sang Gas1-GFP, ang mga selula sang log phase ginpatubo sa bug-os nga gab-i sa YPD kag gintipon paagi sa centrifugation, ginhugasan sing makaduha gamit ang phosphate buffered saline, kag gin-incubate sa yelo sa di-magkubos 15 minutos, kag dayon ginpadayon sa idalom sang mikroskopyo subong sang ginlaragway na sang una Check (24). Ang Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) nga may objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera kag Application Suite X (LAS X) software ang gingamit para sa pag-angkon. .
Ang mga sample gin-denatured gamit ang SDS sample buffer sa 65°C sa sulod sang 10 minutos, kag dayon ginseparar paagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Para sa pag-analisar sang immunoblotting, 10 μl sang sample ang ginkarga kada lane. Panguna nga antibody: Gamita ang rabbit polyclonal anti-Gas1 sa dilution nga 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 sa dilution nga 1:500, kag rabbit polyclonal anti-GFP (isa ka regalo gikan kay H. Riezman) sa dilution nga 1:3000. Ang mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody gingamit sa isa ka dilution nga 1:5000 (isa ka regalo gikan kay J. de la Cruz). Ikaduha nga antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) nga gingamit sa dilution nga 1:3000 (Pierce). Ang HRP-conjugated goat anti-mouse IgG gingamit sa dilution nga 1:3000 (Pierce). Ang immune response zone naobserbahan paagi sa chemiluminescence nga pamaagi sang SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Subong sang ginlaragway sa (31), ang isa ka natural nga eksperimento sa immunoprecipitation ginhimo sa ginpauswag nga ER fraction. Sa malip-ot nga pulong, hugasi ang mga selula sang lebadura gamit ang TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride kag protease inhibitor mixture) sa 600 nm ( OD600) sa 100 optical dens twice denity. Ginbali ini paagi sa mga kuwintas nga bildo, kag dayon ang mga higko sang selula kag mga kuwintas nga bildo ginkuha paagi sa centrifugation. Ang supernatant dayon gin-centrifuge sa 17,000 g sa sulod sang 15 minutos sa 4°C. Ang pellet gin-resuspend sa TNE kag ang digitalis saponin gindugang sa katapusan nga konsentrasyon nga 1%. Ang suspension gin-incubate sa sulod sang 1 ka oras nga may rotation sa 4°C, kag dayon ang indi matunaw nga mga sangkap ginkuha paagi sa centrifugation sa 13,000 g sa 4°C sa sulod sang 60 minutos. Para sa Gas1-GFP immunoprecipitation, una nga i-pre-incubate ang sample nga may empty agarose beads (ChromoTek) sa 4°C sa sulod sang 1 ka oras, kag dayon i-incubate ang GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa sulod sang 3 ka oras. Ang mga immunoprecipitated beads ginhugasan sing lima ka beses gamit ang TNE nga may 0.2% digoxigenin, gin-elute gamit ang SDS sample buffer, ginseparar sa SDS-PAGE, kag gin-analisar paagi sa immunoblotting.
Subong sang ginlaragway sa (31), ang pagdeterminar sang cross-linking ginhimo sa ginpauswag nga ER fraction. Sa malip-ot, ang ginpauswag nga ER nga bahin gin-incubate sa 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ang reaksyon sang crosslinking ginpalong paagi sa pagdugang sang glycine (50 mM nga katapusan nga konsentrasyon, 5 minutos, 20°C).
Subong sang ginlaragway na (50), ang pag-analisar sang MS sang ceramide sa wild-type kag GhLag1 nga mga strain ginhimo. Sa malip-ot nga pulong, ang mga selula ginpatubo sa exponential phase (3 tubtob 4 OD600 units/ml) sa YPD sa 30°C, kag 25×107 ka mga selula ang gin-ani. Ang ila metabolismo ginapalong paagi sa trichloroacetic acid. Gamita ang extraction solvent [ethanol, tubig, ether, pyridine kag 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] kag 1.2 nmol sang internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) nga kalidad). Gamita ang monomethylamine reagent [methanol, tubig, n-butanol kag methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] sa paghimo sang mild alkaline hydrolysis sang extract, kag dayon gamita ang water-saturated n-butanol sa pag-desalt. Sa katapusan, ang extract gin-resuspend sa isa ka positive mode solvent [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] kag gin-inject sa mass spectrometer. Ang multi-reaction monitoring (MRM) ginhimo para sa pagkilala kag pag-isip sang mga molekula sang sphingolipid. Ang TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nasangkapan sang robotic nanoflow ion source Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para sa pag-analisar sang lipid. Ang enerhiya sang pagbungguanay gin-optimize para sa tagsa ka kategorya sang ceramide. Ang datos sang MS nakuha sa positibo nga paagi. Para sa tagsa ka biolohiko nga replika, ang lipid signal amo ang median sang tatlo ka independiente nga mga pagsukol.
Subong sang ginlaragway sa (31), ang mga selula (800×107) nga nagapahayag sang Gas1-GFP ginpaidalom sa natural nga immunoprecipitation. Ang gintinluan nga Gas1-GFP ginseparar paagi sa SDS-PAGE kag ginsaylo sa isa ka polyvinylidene fluoride (PVDF) nga membrane. Ang protina nakita paagi sa pagmantsa sang PVDF gamit ang amide black. Ang Gas1-GFP band gin-utod gikan sa PVDF kag ginhugasan sing 5 ka beses gamit ang methanol kag makaisa gamit ang liquid chromatography-MS (LC-MS) grade water. Paagi sa pag-incubate sang membrane strip nga may 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer kag 500μl nga bag-o lang natunaw nga 1 M sodium nitrite mixture sa 37°C sa sulod sang 3 ka oras, ang lipid fraction ginapaguwa gikan sa Gas1-GFP kag lysed Release sang ininphoosinephosophamiol sa tunga sang ceramioseit kag ceramiosdeit (51). Pagkatapos sadto, ang membrane strip ginhugasan sing apat ka beses gamit ang LC-MS grade nga tubig, ginpamala sa temperatura sang kwarto, kag gintago sa atmospera sang nitroheno sa -80°C tubtob sa pag-analisar. Bilang kontrol, ang isa ka blangko nga sample sang PVDF membrane gingamit para sa tagsa ka eksperimento. Ang lipid nga nakuha gikan sa Gas1-GFP dayon gin-analisar sang MS subong sang ginlaragway (50). Sa malip-ot nga pulong, ang mga strip sang PVDF nga may GPI-lipid gin-resuspend sa 75μl negatibo nga solvent sang agup-op [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] kag nakapasar sa electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Sa sini nga kaso, ang datos sang MS nakuha sa negatibo nga ion mode.
Subong sang ginsambit kaina, ang lipid nga bahin sang GPI anchor ginbulag gikan sa [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Ang mga lipid ginseparar paagi sa thin-layer chromatography gamit ang solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) kag gin-visualize gamit ang FLA-7000 (Fujifilm).
Ang mga selula nga nagapabutyag sang Gas1-GFP (600×107) ginhugasan sing makaduha gamit ang TNE buffer nga may TNE buffer, kag ginbali gamit ang mga glass beads, kag dayon gin-centrifuge agud kuhaon ang mga higko sang selula kag mga glass beads. Ang supernatant dayon gin-centrifuge sa 17,000 g sa sulod sang 1 ka oras sa 4°C. Ang pellet ginhugasan sa TNE kag gin-incubate sa 1 U PI-PLC (Invitrogen) sa TNE nga may 0.2% digitalis saponin sa sulod sang 1 ka oras sa 37°C. Pagkatapos sang pagbulong sang enzyme, ang membrane ginkuha paagi sa centrifugation sa 17,000 g sa 4°C sa sulod sang 1 ka oras. Agod ma-immunoprecipitate ang Gas1-GFP, ang supernatant gin-incubate upod sa GFP-Trap_A (ChromoTek) sa 4°C sa bilog nga gab-i. Ang gintinluan nga Gas1-GFP nga ginseparar sang SDS-PAGE gin-stain sang Coomassie brilliant blue. Ang Gas1-GFP staining band gin-utod gikan sa abohon nga nagapalibot sa aqueduct, kag dayon pagkatapos sang alkylation gamit ang iodoacetamide kag pagnubo gamit ang dithiothreitol, ang in-gel digestion gamit ang trypsin ginhimo. Kuhaa kag pamalahon ang mga tryptic peptide kag peptide nga may GPI-glycans. Ang uga nga peptide gintunaw sa 20 μl sang tubig. I-inject ang isa ka bahin (8μl) sa LC. Ang octadecylsilane (ODS) nga haligi (Develosil 300ODS-HG-5; inner diameter 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) gingamit sa pagseparar sang mga peptide sa idalom sang partikular nga mga kondisyon sang gradient. Ang mobile phase amo ang solvent A (0.08% formic acid) kag solvent B (0.15% formic acid sa 80% acetonitrile). Ang Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) gingamit sa pag-elute sang haligi nga may solvent A sa sulod sang 55 minutos sa flow rate nga 50 μl min-1 sa sulod sang 5 minutos, kag dayon ang konsentrasyon sang solvent B gindugangan sa 40%. , Estados Unidos). Ang eluate padayon nga ginpakilala sa ESI ion source, kag ang mga tryptic peptides kag peptides nga may GPI-glycans gin-analisar sang LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Sa MS setup, ang boltahe sang capillary source ginbutang sa 4.5 kV, kag ang temperatura sang transfer capillary gintipigan sa 300°C. Ang boltahe sang capillary kag boltahe sang lente sang tubo ginbutang sa 15 V kag 50 V, sa magkatuhay. Ang datos sang MS nakuha sa positibo nga ion mode (resolusyon nga 60,000; katukma sang masa nga 10 ka bahin kada milyon) sa isa ka masa nga range sang 300/m/z mass/charge ratio (m/z) 3000. Ang datos sang MS/MS nakuha paagi sa ion trap sa LTQ Orbit [XL) nga una nga nagadepende sa datos collision induced dissociation (CID)].
Ang mga simulation sang MD ginhimo gamit ang GROMACS (52) software kag MARTINI 2 force field (53-55). Ang CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) gingamit dayon sa pagtukod sang isa ka bilayer nga nagaunod sang dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) kag Cer C18 ukon DOPC kag Cer C26. Ang topolohiya kag mga koordinado sang Cer C26 ginkuha gikan sa DXCE paagi sa pagkuha sang dugang nga mga kuwintas gikan sa ikog sang sphingosine. Gamita ang proseso nga ginlaragway sa idalom sa pagbalanse sang doble nga layer kag padalaganon ini, dayon gamita ang katapusan nga mga koordinado sang sistema sa pagtukod sang isa ka sistema nga nagaunod sang Emp24. Ang transmembrane domain sang yeast Emp24 (residues 173 to 193) gintukod bilang α-helix gamit ang visual MD (VMD) tool molecular structure (58). Dayon, pagkatapos nga makuha ang naga-overlap nga mga lipid, ang protina gin-coarsely granulate kag ginsulod sa bilayer gamit ang CHARMM GUI. Ang katapusan nga sistema nagaunod sang 1202 DOPC kag 302 Cer C26 ukon 1197 DOPC kag 295 Cer C18 kag Emp24. Ionize ang sistema sa konsentrasyon nga 0.150M. Apat ka independiente nga mga replika ang ginhimo para sa duha ka bilayer nga komposisyon.
Ang lipid bilayer ginabalanse gamit ang proseso sang CHARMM GUI, nga nagalakip sang pag-minimize kag dayon pagbalanse sang 405,000 ka mga tikang, sa diin ang mga pagpugong sa posisyon amat-amat nga ginabuhinan kag ginadula, kag ang tikang sang oras ginadugangan gikan sa 0.005 ps pakadto sa 0.02 ps. Pagkatapos sang pag-equilibrate, nagapatubas ini sang 6 μs nga may time step nga 0.02 ps. Pagkatapos nga masulod ang Emp24, gamita ang pareho nga proseso sang CHARMM GUI sa pagpanubo kag pagbalanse sang sistema, kag dayon magdalagan sa sulod sang 8 s sa produksyon.
Para sa tanan nga mga sistema, sa tion sang proseso sang pagbalanse, ang presyon ginakontrol sang Berendsen barostat (59), kag sa tion sang proseso sang produksyon, ang presyon ginakontrol sang Parrinello-Rahman barostat (60). Sa tanan nga mga kaso, ang average nga presyon 1 bar kag ang semi-isotropic pressure coupling scheme ang ginagamit. Sa proseso sang balanse kag produksyon, ang isa ka thermostat (61) nga may speed recalibration ginagamit sa pag-couple sang temperatura sang protina, lipid kag solvent particles. Sa bug-os nga operasyon, ang target nga temperatura 310K. Ang non-bonding interaction ginakalkulo paagi sa paghimo sang isa ka listahan sang pagpares gamit ang Verlet scheme nga may 0.005 buffer tolerance. Ang Coulomb term ginakalkulo gamit ang reaction field kag ang cut-off distance nga 1.1 nm. Ang Vander Waals nga termino nagagamit sang isa ka cut-off scheme nga may cut-off distance nga 1.1 nm, kag ang Verlet cut-off scheme ginagamit para sa potensyal nga pag-anod (62).
Gamit ang VMD, ang cutoff wavelength sa tunga sang DOPC phosphate beads ukon ceramide AM1 beads kag ang protina amo ang 0.7 nm, kag ang kadamuon sang mga lipid nga nagapakig-angot sa protina ginakalkulo. Suno sa masunod nga pormula, kalkulaha ang depletion-enrichment (DE) factor pareho sa (63): DE factor = (ang kadamuon sang kabug-usan nga lipids sa protina 0.7) sa protina 0.7 (ang kadamuon sang Cer sa kabug-usan nga lipids)
Ang ginreport nga balor nakuha bilang average, kag ang mga error bar apat ka independente nga kopya sang SE. Ang statistical significance sang DE factor ginakalkulo paagi sa t test [(averageDE-factor-1)/SE]. Kalkulahon ang P value gikan sa one-tailed distribution.
Ang GROMACS nga gamit gingamit sa pagkalkulo sang 2D lateral density map sang sistema nga nagaunod sang Emp24 sa sulod sang katapusan nga 250 ns sang trace. Agod makuha ang mapa sang pagpauswag/pag-ubos sang ceramide, ang mapa sang densidad sang Cer ginatunga sa kabug-usan sang mapa sang Cer kag DOPC, kag dayon ginatunga sa konsentrasyon sang Cer sa lawas. Ang parehas nga kolor nga sukod sa mapa gigamit.
Para sa mga dugang nga materyales para sa sini nga artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Isa ini ka bukas nga artikulo nga ginapanagtag sa idalom sang mga termino sang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, nga nagapahanugot sang paggamit, pagpanagtag kag pagkopya sa bisan ano nga medium, basta ang katapusan nga paggamit indi para sa komersyal nga ganansya kag ang premis amo nga ang orihinal nga obra husto. Reperensya.
Pahibalo: Ginapangabay lang namon sa imo nga ihatag ang imo email address agud mahibaluan sang tawo nga imo ginarekomendar sa pahina nga luyag mo nga makita nila ang email kag indi ini spam. Indi kami magkuha sang bisan ano nga mga email address.
Ini nga pamangkot ginagamit sa pagtilaw kon ikaw isa ka bisita kag pagpugong sang awtomatiko nga pagsumiter sang spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Sererope (Serope), Logazhope (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ang 3D high-resolution real-time imaging nagapakita sang importansya sang kalabaon sang kadena sang ceramide para sa pag-sort sang protina sa selective output sites.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Sererope (Serope), Logazhope (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ang 3D high-resolution real-time imaging nagapakita sang importansya sang kalabaon sang kadena sang ceramide para sa pag-sort sang protina sa selective output sites.
©2020 Asosasyon sang Amerika para sa Pag-uswag sang Siyensya. ang tanan nga mga kinamatarong gintigana. Ang AAAS isa ka partner sang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kag COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.