Present *Current address: Cologne 50931, Germany, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Ang neurodegeneration sang mga balatian sa mitochondria ginakabig nga indi na mabalik bangod ang metabolic plasticity sang mga neuron limitado, apang ang epekto sang mitochondrial dysfunction sa cell autonomy sang neuronal metabolism sa lawas indi maayo nga mahangpan. Diri, ginapakilala namon ang cell-specific proteome sang Purkinje neurons nga may progresibo nga kakulangan sa OXPHOS nga gintuga sang natublag nga mitochondrial fusion dynamics. Nakita namon nga ang mitochondrial dysfunction nagtuga sang isa ka daku nga pagbag-o sa patag sang proteomics, nga sa katapusan nagdul-ong sa sunud-sunod nga pagpaaktibo sang eksakto nga mga programa sa metabolismo antes mapatay ang selula. Sa wala ginapaabot, napat-od namon ang maathag nga induksyon sang pyruvate carboxylase (PCx) kag iban pa nga mga enzyme nga anti-aging nga nagadugang sa mga intermediates sang siklo sang TCA. Ang pagpugong sang PCx nagpalala sang oxidative stress kag neurodegeneration, nga nagapakita nga ang atherosclerosis may proteksyon nga epekto sa mga neuron nga kulang sa OXPHOS. Ang pagpanumbalik sang mitochondrial fusion sa terminally degenerated neurons nagabaliskad sing bug-os sining mga kinaiya sang metabolismo, sa amo nagapugong sang kamatayon sang selula. Ang amon mga natukiban nagakilala sang mga wala pa mahibaluan nga mga alagyan nga nagahatag sang pagkamalig-on sa mitochondrial dysfunction kag nagapakita nga ang neurodegeneration mahimo nga mabalik bisan sa ulihi nga mga hugna sang balatian.
Ang sentro nga papel sang mitochondria sa pagpadayon sang metabolismo sang enerhiya sang neuron ginapadaku sang malapad nga mga sintomas sang neurological nga may kaangtanan sa mga balatian sa mitochondria sang tawo. Ang kalabanan sining mga balatian ginatuga sang mga mutasyon sang gene nga nagakontrol sang ekspresyon sang gene sang mitochondria (1, 2) ukon pagkaguba sang gene nga may kaangtanan sa dinamika sang mitochondria, nga indi direkta nga nagaapektar sa kalig-on sang mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). Ang trabaho sa mga modelo sang sapat nagpakita nga bilang sabat sa mitochondrial dysfunction sa palibot nga mga tisyu, ang konserbatibo nga mga alagyan sang metabolismo (5-7) mahimo nga ma-aktibo, nga nagahatag sang importante nga impormasyon para sa madalom nga paghangop sang pathogenesis sining mga komplikado nga mga balatian. Sa kabaliskaran, ang aton paghangop sa mga pagbag-o sa metabolismo sang partikular nga mga sahi sang selula nga gintuga sang pangkabilugan nga kapaslawan sang produksyon sang mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) sa utok amo ang sadsaran (8), nga nagapadaku sang kinahanglanon sa pagkilala sang mga target sa terapyutik nga mahimo gamiton sa pagtapna ukon pagtapna sang balatian. Likayi ang neurodegeneration (9). Ang kakulang sang impormasyon amo ang kamatuoran nga ang mga selula sang nerbiyos ginakabig nga may limitado gid nga metaboliko nga pagka-flexible kon ipaanggid sa mga sahi sang selula sang mga tisyu sa palibot (10). Bangod ining mga selula may sentro nga papel sa pag-koordinar sang suplay sang mga metabolite sa mga neuron sa pagpasanyog sang synaptic transmission kag pagsabat sa mga kondisyon sang pilas kag balatian, ang ikasarang sa pagpasibu sang metabolismo sang selula sa makahalangkat nga mga kondisyon sang tisyu sang utok halos limitado sa mga selula sang glial (11-14). Dugang pa, ang kinaugali nga pagkatuhay sang selula sang tisyu sang utok sa daku nga bahin nagaupang sa pagtuon sang mga pagbag-o sa metabolismo nga nagakatabo sa partikular nga mga subgrupo sang neuron. Bilang resulta, diutay lang ang nahibaluan parte sa eksakto nga selula kag metaboliko nga mga resulta sang mitochondrial dysfunction sa mga neuron.
Agod mahangpan ang mga resulta sang metabolismo sang mitochondrial dysfunction, gin-isolate namon ang mga Purkinje neurons (PNs) sa nagkalainlain nga hugna sang neurodegeneration nga gintuga sang pagkaguba sang mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). Bisan pa ang mga mutasyon sang Mfn2 sa mga tawo may kaangtanan sa isa ka porma sang hereditary motor sensory neuropathy nga kilala bilang Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), ang kondisyonal nga pagkaguba sang Mfn2 sa mga ilaga isa ka kilala nga induction sang oxidation Phosphorylation (OXPHOS) dysfunction method. Ang nagkalainlain nga mga subtype sang neuron (16-19) kag ang resulta nga neurodegenerative phenotype ginaupdan sang progresibo nga mga sintomas sang neurological, pareho sang mga diperensya sa paghulag (18, 19) ukon cerebellar ataxia (16). Paagi sa paggamit sang kombinasyon sang label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, kag virological nga mga pamaagi, ginapakita namon nga ang progresibo nga neurodegeneration mabaskog nga naga-induce sang pyruvate carboxylase (PCx) kag iban pa nga mga kabangdanan nga nadalahig sa arteriosclerosis sang PNs sa vivo Ang ekspresyon sang mga enzyme. Agod ma-verify ang kaangtanan sini nga natukiban, partikular namon nga gin-down-regulate ang ekspresyon sang PCx sa Mfn2-deficient PNs, kag nakita nga ini nga operasyon nagpalala sang oxidative stress kag nagpadasig sang neurodegeneration, gani nagapamatuod nga ang azoospermia nagahatag sang kamatayon sang selula Metabolic adaptability. Ang grabe nga ekspresyon sang MFN2 makaluwas sing bug-os sa terminal degeneration PN nga may grabe nga kakulangan sa OXPHOS, madamo nga pagkonsumo sang mitochondrial DNA, kag maathag nga nabali nga mitochondrial network, nga dugang nga nagapadaku nga ini nga porma sang neurodegeneration mahimo pa gani mag-ayo sa abanse nga yugto sang balatian antes mapatay ang selula.
Agod makita ang mitochondria sa Mfn2 knockout PNs, naggamit kami sang isa ka mouse strain nga nagatugot sa Cre-dependent mitochondria nga mag-target sang yellow fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression kag gin-usisa ang mitochondrial morphology sa vivo. Nakita namon nga ang pagkaguba sang Mfn2 gene sa PNs magadul-ong sa amat-amat nga pagbahinbahin sang mitochondrial network (Figure S1A), kag ang pinakauna nga pagbag-o nakita sa 3 ka semana nga edad. Sa kabaliskaran, ang substansiyal nga pagkaguba sang PN cell layer, subong sang ginapamatud-an sang pagkadula sang Calbindin immunostaining, wala nagsugod tubtob sa 12 ka semana nga edad (Figure 1, A kag B). Ang indi pag-alalangay sang oras sa tunga sang pinakauna nga mga pagbag-o sa morpolohiya sang mitochondrial kag ang makita nga pagsugod sang kamatayon sang neuron nagtiklod sa amon sa pag-usisa sang mga pagbag-o sa metabolismo nga gintunaan sang dysfunction sang mitochondrial antes sang kamatayon sang selula. Naghimo kami sang isa ka estratehiya nga nakabase sa fluorescence-activated cell sorting (FACS) sa pag-isolate sang YFP (YFP+)-expressing PN (Figure 1C), kag sa mga ilaga nga kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), nga ginatawag diri nga CTRL (Figure S1BRL). Ang pag-optimize sang estratehiya sa pag-gate base sa relatibo nga intensidad sang signal sang YFP nagapahanugot sa aton nga tinluan ang YFP+ nga lawas (YFPhigh) sang PNs gikan sa mga non-PNs (YFPneg) (Figure S1B) ukon putative fluorescent axon/dendritic fragments (YFPlow; Figure S1D, wala), nga ginkumpirma sang confocal microscope (Figure S1D, tuo). Agod ma-verify ang identidad sang ginklasipikar nga populasyon, nagpatigayon kami sang LFQ proteomics kag dayon pag-analisar sang panguna nga bahin, kag nakita nga may maathag nga pagbulagay sa tunga sang YFPhigh kag YFPneg nga mga selula (Figure S1C). Ang mga selula sang YFPhigh nagpakita sang isa ka net enrichment sang nahibal-an nga mga PNs markers (ie Calb1, Pcp2, Grid2 kag Itpr3) (21, 22), apang wala sing enrichment sang mga protina nga kinaandan nga ginapabutyag sa mga neuron ukon iban pa nga mga sahi sang selula (Figure 1D) ). Ang pagtandi sa tunga sang mga sample sa ginklasipikar nga mga selula sang YFPhigh nga nakolekta sa independente nga mga eksperimento nagpakita sang isa ka correlation coefficient> 0.9, nga nagapakita sang maayo nga reproducibility sa tunga sang mga biological replicates (Figure S1E). Sa pagsumaryo, ini nga mga datos nag-validate sang amon plano para sa acute kag partikular nga pag-isahanon sang posible nga PN. Bangod ang L7-cre driver system nga gingamit naga-induce sang mosaic recombination sa una nga semana pagkatapos sang pagpanganak (23), nagsugod kami sa pag-utod sang mga ilaga gikan sa CTRL kag conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Collect neurons. Pagkatapos sang rekombinasyon, ginatawag ini nga Mfn2cKO sa edad nga 4 ka semana. Bilang katapusan nga punto, ginpili namon ang 8 ka semana nga edad sang ang PN layer wala maano walay sapayan sang maathag nga pagkabahinbahin sang mitochondrial (Figure 1B kag Figure S1A). Sa kabilugan, gin-quantify namon ang kabug-usan nga 3013 ka mga protina, nga mga 22% sini ang nabase sa MitoCarta 2.0 nga mga anotasyon base sa mitochondrial proteome bilang mitochondria (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Ang differential gene expression analysis nga ginhimo sa semana 8 nagpakita nga 10.5% lamang sang tanan nga mga protina ang may daku nga mga pagbag-o (Figure 1F kag Figure S1F), sa diin 195 ka mga protina ang gin-down-regulate kag 120 ka mga protina ang gin-up-regulate (Figure 1F). Talalupangdon nga ang "makabag-o nga pag-analisar sang alagyan" sang sini nga hugpong sang datos nagapakita nga ang mga gene nga ginpabutyag sing tuhay nagapanguna nga iya sang isa ka limitado nga hugpong sang partikular nga mga alagyan sang metabolismo (Figure 1G). Sing makawiwili, bisan pa nga ang pag-downregulate sang mga alagyan nga may kaangtanan sa OXPHOS kag calcium signaling nagapamatuod sang induction sang mitochondrial dysfunction sa fusion-deficient PNs, ang iban nga mga kategorya nga nagalakip sang amino acid metabolism ang may daku nga pag-upregulate, nga nagasanto sa metabolismo nga nagakatabo sa mitochondrial PNs nga ang rewiring consistent. pagkaguba.
(A) Representatibo nga mga litrato sang confocal sang mga seksyon sang cerebellar sang CTRL kag Mfn2cKO nga mga ilaga nga nagapakita sang progresibo nga pagkadula sang PNs (calbindin, gray); ang mga nuclei ginkontra sa DAPI. (B) Pag-isip sang (A) (isa ka paagi nga pag-analisar sang pagkatuhay, ***P<0.001; n = 4 tubtob 6 ka mga sirkulo gikan sa tatlo ka mga ilaga). (C) Eksperimento nga dalagan sang trabaho. (D) Heat map distribution sang mga marker nga partikular sa Purkinje (ibabaw) kag iban pa nga mga sahi sang selula (tunga). (E) Venn diagram nga nagapakita sang kadamuon sang mga protina sang mitochondrial nga nakilala sa ginklasipikar nga PN. (F) Volcano plot sang differentially expressed proteins sa Mfn2cKO neurons sa 8 ka semana (significance cut-off value sang 1.3). (G) Ang pag-analisar sang alagyan sang pagkamamugnaon nagapakita sang lima ka pinakaimportante nga up-regulation (pula) kag down-regulation (asul) nga mga alagyan sa Mfn2cKO PN nga ginklasipikar bilang 8 ka semana. Ang average nga lebel sang ekspresyon sang tagsa ka natukiban nga protina ginapakita. Grayscale heat map: gin-adjust nga P value. ns, indi importante.
Ang datos sang proteomics nagpakita nga ang ekspresyon sang protina sang mga komplikado I, III, kag IV amat-amat nga nagnubo. Ang mga complex I, III, kag IV tanan nagaunod sang importante nga mtDNA-encoded subunits, samtang ang complex II, nga nuclear-coded lamang, wala gid maapektuhan (Figure 2A kag Figure S2A). . Nahisanto sa mga resulta sang proteomics, ang immunohistochemistry sang mga seksyon sang tisyu sang cerebellar nagpakita nga ang MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit nga lebel sang complex IV sa PN amat-amat nga nagnubo (Figure 2B). Ang mtDNA-encoded subunit Mtatp8 nagnubo sing daku (Figure S2A), samtang ang steady-state nga lebel sang nuclear-encoded ATP synthase subunit nagpabilin nga wala magbag-o, nga nagahisanto sa nahibal-an nga stable ATP synthase subassembly F1 complex kon ang mtDNA expression stable. Ang pormasyon makanunayon. Mag-upang (7). Ang pag-ebalwar sang lebel sang mtDNA sa gin-sort nga Mfn2cKO PNs paagi sa real-time polymerase chain reaction (qPCR) nagpamatuod sang amat-amat nga pagnubo sang numero sang kopya sang mtDNA. Kon ipaanggid sa grupo nga kontrol, sa 8 ka semana nga edad, mga 20% lamang sang lebel sang mtDNA ang nabilin (Figure 2C). Nahisanto sa sini nga mga resulta, ang confocal microscopy staining sang Mfn2cKO PNs gingamit sa pag-detect sang DNA, nga nagapakita sang time-dependent nga pagkonsumo sang mitochondrial nucleotides (Figure 2D). Nakita namon nga ang pila lamang ka mga kandidato nga nadalahig sa pagkaguba sang protina sang mitochondrial kag sabat sa stress ang gin-up-regulate, lakip ang Lonp1, Afg3l2 kag Clpx, kag OXPHOS complex assembly factors. Wala sing daku nga mga pagbag-o sa lebel sang mga protina nga nadalahig sa apoptosis ang natukiban (Figure S2B). Sing kaanggid, nakita namon nga ang mitochondria kag endoplasmic reticulum channels nga nadalahig sa transportasyon sang calcium may yara lamang sang diutay nga mga pagbag-o (Figure S2C). Dugang pa, ang pagtimbangtimbang sang mga protina nga may kaangtanan sa autophagy wala sing nakita nga mga pagbag-o, nga nagahisanto sa makita nga induksyon sang mga autophagosomes nga naobserbahan sa vivo paagi sa immunohistochemistry kag electron microscopy (Figure S3). Apang, ang progresibo nga OXPHOS dysfunction sa PNs ginaupdan sang maathag nga mga pagbag-o sa ultrastructural mitochondrial. Ang mga grupo sang mitochondrial makita sa mga lawas sang selula kag mga puno sang dendritic sang Mfn2cKO PNs nga naga-edad 5 kag 8 ka semana, kag ang istruktura sang nasulod nga membrane nag-agi sa madalom nga mga pagbag-o (Figure S4, A kag B). Nahisuno sa sini nga mga pagbag-o sa ultrastructural kag isa ka daku nga pagnubo sa mtDNA, ang pag-analisar sang acute cerebral cerebellar slices nga may tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nagpakita nga ang potensyal sang mitochondrial membrane sa Mfn2cKO PNs daku nga nagnubo (Figure S4C).
(A) Pag-analisar sang kurso sang oras sang lebel sang ekspresyon sang OXPHOS complex. Binagbinaga lamang ang mga protina nga may P<0.05 sa 8 ka semana (two-way ANOVA). Tuldok nga linya: Wala sing pag-adjust kon ipaanggid sa CTRL. (B) Wala: Isa ka halimbawa sang isa ka seksyon sang cerebellar nga may marka nga anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar nga ginaokupar sang mga lawas sang selula sang Purkinje ginatabunan sang dilaw. Tuo: Pag-isip sang lebel sang MTCO1 (isa ka paagi nga pag-analisar sang pagkatuhay; n = 7 tubtob 20 ka mga selula nga gin-analisar gikan sa tatlo ka ilaga). (C) qPCR nga pag-analisar sang numero sang kopya sang mtDNA sa gin-sort nga PN (isa ka paagi nga pag-analisar sang variance; n = 3 tubtob 7 ka mga ilaga). (D) Wala: Isa ka halimbawa sang isa ka cerebellar slice nga may marka nga anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). Ang lugar nga ginaokupar sang mga lawas sang selula sang Purkinje ginatabunan sang dilaw. Tuo: Pag-isip sang mga samad sang mtDNA (isa ka paagi nga pag-analisar sang pagkatuhay; n = 5 tubtob 9 ka mga selula gikan sa tatlo ka ilaga). (E) Isa ka halimbawa sang isa ka acute cerebellar section nga nagapakita sang mitoYFP + Purkinje cells (pana) sa isa ka whole-cell patch clamp recording. (F) Pag-isip sang kurba sang IV. (G) Representatibo nga mga rekording sang depolarizing current injection sa CTRL kag Mfn2cKO Purkinje cells. Top trace: Ang una nga pulso nga nag-trigger sang AP. Bottom trace: Maximum AP frequency. (H) Pag-isip sang mga postsynaptic spontaneous inputs (sPSPs). Ang representante nga recording trace kag ang zoom ratio sini makita sa (I). Ang isa ka paagi nga pag-analisar sang pagkatuhay nag-analisar sang n = 5 tubtob 20 ka mga selula gikan sa tatlo ka mga ilaga. Ang mga datos ginapabutyag bilang mean±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Ang mga tiglawas nga mga agi sang spontaneous AP nga narekord gamit ang perforated patch clamp mode. Top trace: Maximum AP frequency. Bottom trace: zoom sang isa ka AP. (K) I-quantify ang average kag maximum nga AP frequency suno sa (J). Mann-Whitney test; n = 5 ka mga selula ang gin-analisar gikan sa apat ka mga ilaga. Ang mga datos ginapabutyag bilang mean±SEM; indi importante.
Ang maathag nga kahalitan sang OXPHOS natukiban sa 8-semana nga Mfn2cKO PN, nga nagapakita nga ang physiological function sang mga neuron tuman ka abnormal. Gani, gin-analisar namon ang passive electrical characteristics sang OXPHOS-deficient neurons sa 4 tubtob 5 ka semana kag 7 tubtob 8 ka semana paagi sa paghimo sang whole-cell patch clamp recordings sa acute cerebellar slices (Figure 2E). Sa wala ginapaabot, ang average nga resting membrane potential kag input resistance sang Mfn2cKO neurons kaanggid sa kontrol, bisan pa nga may yara sang mahinay nga mga kinatuhayan sa tunga sang mga selula (Table 1). Sing kaanggid, sa 4 tubtob 5 ka semana nga edad, wala sing daku nga mga pagbag-o sa kaangtanan sang karon-boltahe (IV curve) ang nakita (Figure 2F). Apang, wala sing Mfn2cKO neurons nga 7 tubtob 8 ka semana ang edad ang nakalampuwas sa IV regimen (hyperpolarization step), nga nagapakita nga may yara sang maathag nga pagkasensitibo sa hyperpolarization potential sa sini nga ulihi nga yugto. Sa kabaliskaran, sa Mfn2cKO neurons, ang mga depolarizing currents nga nagatuga sang repetitive action potential (AP) discharges ginatugot sing maayo, nga nagapakita nga ang ila kabug-usan nga mga pattern sang discharge indi tuhay sing daku sa mga 8-semana-old control neurons (Table 1 kag Figure 2G). Sing kaanggid, ang frequency kag amplitude sang spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) kaanggid sa mga control group, kag ang frequency sang mga hitabo nagdugang halin sa 4 ka semana pakadto sa 5 ka semana pakadto sa 7 ka semana pakadto sa 8 ka semana nga may kaanggid nga pagtaas (Figure 2, H kag I). Ang panahon sang paghamtong sang synaptic sa PNs (25). Ang kaanggid nga mga resulta nakuha pagkatapos sang mga perforated PNs patches. Ini nga pagsulundan nagapugong sang posible nga pagbayad sang mga depekto sang ATP sang selula, subong sang mahimo matabo sa pagrekord sang patch clamp sang bug-os nga selula. Sa partikular, ang resting membrane potential kag ang spontaneous firing frequency sang Mfn2cKO neurons wala maapektuhan (Figure 2, J kag K). Sa pagsumaryo, ini nga mga resulta nagapakita nga ang mga PN nga may maathag nga OXPHOS dysfunction makalandas sing maayo sa mga high-frequency discharge patterns, nga nagapakita nga may yara sang mekanismo sang kompensasyon nga nagatugot sa ila nga magpadayon sang malapit-normal nga mga sabat sa electrophysiological.
Ang mga datos ginapabutyag bilang mean ± SEM (one-way analysis of variance, Holm-Sidak's multiple comparison test; *P<0.05). Ang numero sang yunit ginapakita sang mga braket.
Nagsugod kami sa pag-usisa kon ang bisan ano nga kategorya sa proteomics dataset (Figure 1G) nagalakip sang mga alagyan nga makakontra sa grabe nga kakulangan sang OXPHOS, sa amo nagapaathag kon ngaa ang apektado nga PN makapadayon sang malapit-normal nga electrophysiology (Figure 2, E to K). . Ang pag-analisar sang proteomics nagpakita nga ang mga enzyme nga nadalahig sa catabolism sang branched chain amino acids (BCAA) may daku nga pag-up-regulate (Figure 3A kag Figure S5A), kag ang katapusan nga produkto nga acetyl-CoA (CoA) ukon succinyl CoA mahimo magdugang sa mga tricarboxylates sa arteriosclerosis Acid (TCA) cycle. Nakita namon nga ang kaundan sang BCAA transaminase 1 (BCAT1) kag BCAT2 pareho nga nagtaas. Gina-catalyze nila ang una nga tikang sang BCAA catabolism paagi sa paghimo sang glutamate gikan sa α-ketoglutarate (26). Ang tanan nga mga subunit nga nagahuman sang branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex gina-upregulate (ang complex naga-catalyze sang masunod kag indi na mabalik nga decarboxylation sang resulta nga BCAA carbon skeleton) (Figure 3A kag Figure S5A). Apang, wala sing maathag nga mga pagbag-o sa BCAA mismo ang nakita sa gin-sort nga PN, nga mahimo bangod sang pagdugang sang pagkuha sang selula sining importante nga mga amino acid ukon ang paggamit sang iban nga mga ginhalinan (glucose ukon lactic acid) sa pagdugang sa siklo sang TCA (Figure S5B). Ang mga PN nga kulang sa OXPHOS nagpakita man sang dugang nga glutamine decomposition kag transamination activities sa 8 ka semana nga edad, nga mahimo makita sang up-regulation sang mitochondrial enzymes glutaminase (GLS) kag glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A kag C). Dapat talupangdon nga ang up-regulation sang GLS limitado sa spliced ​​fisoform glutaminase C (GLS-GAC) (ang pagbag-o sang Mfn2cKO/CTRL ginabanta nga 4.5-fold, P = 0.05), kag ang iya partikular nga up-regulation sa mga tisyu sang kanser Makasuporta sa mitochondrial bioenergy bioenergy. (27).
(A) Ang mapa sang init nagapakita sang pagbag-o sang lebel sang protina para sa gintalana nga ruta sa 8 ka semana. (B) Halimbawa sang isa ka cerebellar slice nga may marka nga anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). Ang dilaw nga pana nagatudlo sa lawas sang selula sang Purkinje. (C) Ang pag-analisar sang ekspresyon sang protina sa kurso sang oras nga nakilala bilang isa ka importante nga kandidato para sa atherosclerosis (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 nga mga ilaga). (D) Sa ibabaw: Isa ka schematic diagram nga nagapakita sang nagkalainlain nga mga paagi sa pagsulod sa ginmarkahan nga carbon nga yara sa [1-13C]pyruvate tracer (ie, paagi sa PDH ukon trans-arterial nga ruta). Ubos: Ang violin chart nagapakita sang porsyento sang single-labeled carbon (M1) nga ginbaylo sa aspartic acid, citric acid kag malic acid pagkatapos nga ginmarkahan ang acute cerebellar slices nga may [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Komprehensibo nga pag-analisar sang maragtas sang tion sang ginpakita nga banas. Binagbinaga lamang ang mga protina nga may P<0.05 sa 8 ka semana. Dashed line: wala sang adjustment value (two-way analysis of variance; * P <0.05; *** P <0.001). Ang mga datos ginapabutyag bilang mean±SEM.
Sa amon pag-analisar, ang BCAA catabolism nangin isa sa mga yabi nga mga alagyan sang pag-up-regulate. Ini nga kamatuoran mabaskog nga nagapakita nga ang kadamuon sang bentilasyon nga nagasulod sa siklo sang TCA mahimo nga mabag-o sa PN nga kulang sa OXPHOS. Mahimo ini magrepresentar sang isa ka mayor nga porma sang neuronal metabolic rewiring, nga mahimo nga may direkta nga epekto sa neuronal physiology kag survival sa tion sang pagmentinar sang grabe nga OXPHOS dysfunction. Nahisanto sa sini nga hypothesis, nakita namon nga ang panguna nga anti-atherosclerotic enzyme PCx gina-up-regulate (Mfn2cKO/CTRL nagabag-o sing mga 1.5 ka beses; Figure 3A), nga naga-catalyze sang pagbaylo sang pyruvate sa oxaloacetate (28), nga ginapatihan nga sa brainsutes Ang ekspresyon sang utok ginalimitahan sa astrocytes (29, 30). Nahisanto sa mga resulta sang proteomics, ang confocal microscopy nagpakita nga ang PCx expression partikular kag makahulugan nga nagdugang sa OXPHOS-deficient PNs, samtang ang PCx reactivity panguna nga limitado sa kaiping nga Bergmann glial cells sang kontrol (Figure 3B). Agod ma-functionally test ang naobserbahan nga upregulation sang PCx, gintratar namon ang acute cerebellar slices nga may [1-13C]pyruvate tracer. Sang ang pyruvate gin-oxidize sang pyruvate dehydrogenase (PDH), ang iya isotope label nadula, Apang ginlakip sa TCA cycle intermediates kon ang pyruvate gin-metabolize sang vascular reactions (Figure 3D). Bilang suporta sa amon datos sang proteomics, naobserbahan namon ang madamo nga mga marker gikan sa sini nga tracer sa aspartic acid sang mga hiwa sang Mfn2cKO, samtang ang citric acid kag malic acid may yara man sang kasarangan nga huyog, bisan pa nga indi makahulugan (Figure 3D).
Sa mga dopamine neuron sang MitoPark nga mga ilaga nga may mitochondrial dysfunction nga gintuga sang dopamine neuron nga partikular nga nagaguba sang mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Figure S6B), ang ekspresyon sang PCx nangin up-regulate man sing daku (31), nga nagapakita nga ang acetone acid arteriosclerosis Ang pagluntad sang balatian gina-regulate sa tion sang dysfunction sang neuron OXPHOS sa lawas. Talalupangdon nga natukiban nga ang pinasahi nga mga enzyme (32-34) nga mahimo nga ginapabutyag sa mga neuron nga mahimo nga may kaangtanan sa arteriosclerosis may daku nga pag-up-regulate sa mga PN nga kulang sa OXPHOS, pareho sang propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), ang Malonyl-CoA nagabaylo sang propionyl-CoA sa propionyl-CoA kag malichondrial enzyme 3 (ME3), nga ang panguna nga papel amo ang pagbawi sang pyruvate gikan sa malate (Figure 3, A kag C) (33, 35). Dugang pa, nakita namon ang isa ka daku nga pagtaas sa Pdk3 enzyme, nga naga-phosphorylate kag gani naga-inactivate sang PDH (36), samtang wala sing mga pagbag-o nga nakit-an sa Pdp1 enzyme nga naga-activate sang PDH ukon sa PDH enzyme complex mismo (Figure 3A). Sa dalayon, sa Mern2cKO PNs, ang phosphorylation sang α1 subunit α (PDHE1α) subunit sang pyruvate dehydrogenase E1 nga bahin sang PDH complex sa Ser293 (nahibaluan nga nagapugong sang aktibidad sang enzyme sang PDH) ginpauswag ( Figure S6C) (Figure S6C). Ang pyruvate wala sing vascular access.
Sa katapusan, nakita namon nga ang super pathway sang serine kag glycine biosynthesis, ang may kaangtanan nga mitochondrial folate (1C) cycle kag proline biosynthesis (Figure 1G kag Figure S5C) tanan nga makahulugan nga up-regulated, suno sa mga report, sa tion sang proseso sang pagpaaktibo. Ang mga tisyu sa palibot gina-aktibo paagi sa mitochondrial dysfunction (5-7). Ang confocal analysis nga nagasuporta sa sini nga mga datos sang proteomics nagpakita nga sa PN nga may OXPHOS nga nadula, ang mga hiwa sang cerebellar sang 8-semana nga mga ilaga ginpaidalom sa serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), isa ka yabi nga enzyme sang mitochondrial folate cycle. Makahulugan nga sabat sang imyunidad (Figure S5D). Sa 13 ka CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, ang mga eksperimento sa metabolic tracing dugang nga nagkumpirma sang up-regulation sang serine kag proline biosynthesis, nga nagapakita nga ang pag-ilig sang carbon isoforms sa serine kag proline nagdugang (Figure S5E). Sanglit ang mga reaksyon nga ginapasanyog sang GLS kag GPT2 amo ang responsable sa pag-synthesize sang glutamate gikan sa glutamine kag ang transamination sa tunga sang glutamate kag α-ketoglutarate, ang ila upregulation nagapakita nga ang mga neuron nga kulang sa OXPHOS may dugang nga demand para sa glutamate , Mahimo ini nga nagatuyo sa pagpadayon sang dugang nga biosynthesis sang proline (Figure S5). Sa kabaliskaran sa sini nga mga pagbag-o, ang isa ka proteomic nga pag-analisar sang mga cerebellar astrocytes gikan sa PN-specific Mfn2cKO nga mga ilaga nagpakita nga ining mga alagyan (lakip ang tanan nga antiperoxidases) wala magbag-o sing daku sa ekspresyon, gani nagapakita nga Ini nga metaboliko nga pag-redirection mapilion sa degraded PN (Fig. S6, D to G).
Sa pagsumaryo, ini nga mga pag-analisar nagpakita sang mahinungdanon nga nagkalainlain nga mga sulundan sang temporal nga pagpaaktibo sang partikular nga mga metaboliko nga mga alagyan sa PNs. Bisan pa ang abnormal nga neuronal mitochondrial function mahimo magdul-ong sa temprano nga atherosclerosis kag 1C remodeling (Figure 3E kag Figure S5C), kag bisan ang mga pagbag-o sa ekspresyon sang I kag IV complexes, ang mga pagbag-o sa serine de novo synthesis amo lamang ini nangin maathag sa ulihi nga mga hugna. OXPHOS dysfunction (Figure 3E kag Figure S5C). Ini nga mga natukiban nagahatag sang kahulugan sang isa ka sunud-sunod nga proseso sa diin ang stress-induced mitochondrial (1C cycle) kag cytoplasmic (serine biosynthesis) nga sabat nagabuligay sa pagdugang sang atherosclerosis sa TCA cycle sa pag-reshape sang neuronal metabolism.
Ang 8-semana nga edad nga OXPHOS-deficient PNs makapadayon sang mataas nga frequency nga aktibidad sang pagpukaw kag mag-agi sa makahulugan nga metaboliko nga pagkonektar liwat sa pagbayad para sa mitochondrial dysfunction. Ini nga pagtukib nagapautwas sang isa ka makawiwili nga posibilidad nga bisan sa sini nga tion, ining mga selula mahimo man makabaton sang terapyutik nga pagpasilabot sa pagpadugay ukon pagpugong sang neurodegeneration. Ulihi. Ginsolbar namon ini nga posibilidad paagi sa duha ka independiente nga mga interbensyon. Sa una nga pamaagi, nagdesinyo kami sang Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector agud nga ang MFN2 mahimo nga mapili nga mapahayag sa OXPHOS-deficient PNs sa vivo (Figure S7A). Ang AAV nga naga-encode sang MFN2 kag ang fluorescent reporter gene nga mCherry (Mfn2-AAV) gin-verify sa panguna nga mga kultura sang neuron sa vitro, nga nagtuga sang MFN2 nga ma-express sa isa ka Cre-dependent nga paagi kag nagluwas sang mitochondrial morphology, sa amo napunggan ang neuromutation sa Mfn2cKO neurons ( Figure S7, D, B kag D). Masunod, naghimo kami sang mga eksperimento sa vivo sa paghatag sang 8-semana nga Mfn2-AAV sa cerebellar cortex sang Mfn2cKO kag mga ilaga nga kontrol, kag gin-analisar ang 12-semana nga mga ilaga (Figure 4A). Ang ginbulong nga Mfn2cKO nga mga ilaga napatay (Figure 1, A kag B) (16). Ang viral transduction sa vivo nagresulta sa selective expression sang PN sa pila ka cerebellar circles (Figure S7, G kag H). Ang pag-indyeksion sang kontrol nga AAV nga nagapabutyag lamang sang mCherry (Ctrl-AAV) wala sing daku nga epekto sa kadakuon sang neurodegeneration sa mga sapat nga Mfn2cKO. Sa kabaliskaran, ang pag-analisar sang Mfn2cKOs nga gin-transduce gamit ang Mfn2-AAV nagpakita sang isa ka makahulugan nga proteksyon nga epekto sang PN cell layer (Figure 4, B kag C). Sa partikular, ang densidad sang neuron daw halos indi makilala gikan sa mga sapat nga kontrol (Figure 4, B kag C, kag Figure S7, H kag I). Ang ekspresyon sang MFN1 apang indi MFN2 pareho nga epektibo sa pagluwas sang neuronal death (Figure 4C kag Figure S7, C kag F), nga nagapakita nga ang ekspresyon sang ectopic MFN1 epektibo nga makadugang sa kakulang sang MFN2. Ang dugang nga pag-analisar sa isa ka lebel sang PN nagpakita nga ang Mfn2-AAV sa daku nga bahin nagluwas sang ultrastructure sang mitochondria, nag-normalize sang lebel sang mtDNA, kag nagbaliskad sang mataas nga ekspresyon sang anti-angiogenesis marker PCx ​​(Figure 4, C to E ). Ang biswal nga pag-usisa sa mga naluwas nga Mfn2cKO nga mga ilaga sa isa ka nagapahuway nga estado nagpakita nga ang ila postura kag mga sintomas sa motor (paghulag S1 tubtob S3) nag-uswag. Sa konklusyon, ginapakita sini nga mga eksperimento nga ang atrasado nga pagpakilala liwat sang MFN2 sa mga PN nga kulang gid sa OXPHOS bastante na sa pagbaliskad sang pagkonsumo sang mtDNA kag pag-induce sang atherosclerosis, sa amo nagapugong sang pagkaguba sang axon kag neuronal death sa vivo.
(A) Isa ka iskema nga nagapakita sang eksperimento nga iskedyul para sa pag-indyeksion sang AAV nga naga-encode sang MFN2 kon ang ginapakita nga metaboliko nga alagyan gina-aktibo. (B) Mga representante nga confocal nga mga laragway sang 12-semana nga mga hiwa sang cerebellar nga gin-transduce sa 8 ka semana sa Mfn2cKO nga mga ilaga kag ginmarkahan sang anti-Calbindin antibody. Tuo: Pag-scale sang mga lanot sang axon. Ang kadakuon sang axon zoom 450 kag 75 μm. (C) Wala: Pag-isip sang Purkinje cell density sa AAV transduction loop (AAV+) (one-way analysis of variance; n = 3 mice). Tuo: pag-analisar sang mtDNA focus sa transduced PN sa semana 12 (unpaired t-test; n = 6 cells gikan sa tatlo ka ilaga). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Representatibo nga transmission electron micrographs sang PNs sang Mfn2cKO cerebellar sections nga gin-transduce gamit ang ginpakita nga viral vectors. Ang pink nga maskara nagalaragway sang lugar nga gina-okupar sang mga dendrite, kag ang yellow dotted square nagalaragway sang zoom nga ginhatag sa tuo; ang n nagarepresentar sang nucleus. Scale bar, 1μm. (E) nagapakita sang isa ka halimbawa sang PCx staining sa PN nga gin-transduce sa 12 ka semana. Scale bar, 20μm. OE, sobra nga pagpahayag; FC, pilo nga pagbag-o.
Sa katapusan, gin-usisa namon ang importansya sang peroxidase-induced cell survival sa mga PN nga nakaeksperyensya sang OXPHOS dysfunction. Naghimo kami sang mCherry nga naga-encode sang AAV-shRNA (malip-ot nga hairpin RNA) nga partikular nga nagapuntirya sa mouse PCx mRNA (AAV-shPCx), kag gin-inject ang virus ukon ang iya scrambled control (AAV-scr) sa cerebellum sang Mfn2cKO nga mga ilaga. Ang indeyksiyon ginhimo sa ikaapat nga semana sang edad (Figure 5A) agud matigayon ang epektibo nga PCx knockdown sa tion nga ang PCx expression nagdugang (Figure 3C) kag ang PN cell layer wala pa maano (Figure 1A). Talalupangdon nga ang pagtumba sa PCx (Figure S8A) nagadul-ong sa isa ka daku nga pagpadasig sang kamatayon sang PN, nga limitado sa natapikan nga singsing (Figure 5, B kag C). Agod mahangpan ang mekanismo sang mga epekto sa metabolismo nga gintuga sang PCx up-regulation, gintun-an namon ang redox status sang PNs pagkatapos sang PCx knockdown kag ang AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 dungan nga ginpabutyag (Figure S8, B to D) sa pag-ebalwar sang glutathione Ang relatibo nga pagbag-o sang redox peptide potential (388). Dayon, naghimo kami sang two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) sa acute brain slices sang 7-week-old Mfn2cKO ukon control littermates agud makita ang posible nga mga pagbag-o sa cytoplasmic redox status pagkatapos nga ma-verify ang mga kondisyon sang FLIM (Figure S8, E to G). Ang pag-analisar nagpakita sang isa ka daku nga pagtaas sa estado sang oksihenasyon sang isa ka Mfn2cKO PNs nga kulang sa PCx expression, nga tuhay sa mga control neurons ukon Mfn2cKO PNs nga nagapahayag lamang sang scrambled shRNA (Figure 5, D kag E). Sang ang ekspresyon sang PCx gin-down-regulate, ang porsyento sang Mfn2cKO PNs nga nagapakita sang isa ka mataas nga oxidized nga estado nagdugang sang kapin sa tatlo ka beses (Figure 5E), nga nagapakita nga ang PCx up-regulation nagmintinar sang redox nga kapasidad sang degenerated neurons.
(A) Isa ka iskema nga nagapakita sang eksperimento nga iskedyul para sa pag-indyeksion sang AAV nga naga-encode sang shPCx kon ang ginapakita nga metaboliko nga alagyan gina-aktibo. (B) Representatibo nga mga litrato sang confocal sang 8-semana nga mga seksyon sang cerebellar sa Mfn2cKO nga mga ilaga nga gin-transduce kag ginmarkahan sang anti-calcineurin antibody sa 4 ka semana. Scale bar, 450μm. (C) Pag-isip sang Purkinje cell density sa AAV-transduced loops (isa ka paagi nga pag-analisar sang variance; n = 3 tubtob 4 ka mga ilaga). Ang mga datos ginapabutyag bilang mean±SEM; ***P<0.001. (D) Ang representante nga laragway sang FLIM nagapakita sang average nga kalawigon sang kabuhi sang 7-semana nga PN nga nagapahayag sang glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 sa idalom sang gintalana nga mga kondisyon sa eksperimento. LUT (look-up table) ratio: survival time interval (sa picoseconds). Scale bar, 25μm. (E) Ang histogram nagapakita sang distribusyon sang Grx1-roGFP2 nga mga balor sang kabuhi gikan sa (D) (n=158 tubtob 368 ka mga selula sa duha ka ilaga sa idalom sang tagsa ka kondisyon). Ang pie chart sa ibabaw sang tagsa ka histogram: nagapakita sang kadamuon sang mga selula nga may mas malawig (pula, oxidized) ukon mas malip-ot (asul, ginbuhinan) nga mga balor sang kabuhi, nga nagasobra sa 1 SD sang average nga balor sang kabuhi sa CTRL-AAV-scr. (F) Ang ginproponer nga modelo nagapakita sang nagaamlig nga epekto sang pag-uswag sang neuronal PCx.
Sa kabilugan, ang datos nga amon ginahatag diri nagapakita nga ang pagpahayag liwat sang MFN2 makaluwas sing bug-os sa advanced PN nga may grabe nga kakulangan sa OXPHOS, grabe nga pag-ubos sang mtDNA, kag tuman ka abnormal nga ista-like morphology, sa amo nagahatag sang padayon nga pag-uswag bisan sa advanced nga mga balatian. Ang neurodegeneration nagahatag sang mabalik nga ebidensya sang yugto antes sang kamatayon sang selula. Ini nga lebel sang metaboliko nga pagka-flexible labi nga ginapadaku sang ikasarang sang mga neuron sa pag-induce sang atherosclerosis (isa ka pag-rewiring sang TCA cycle), nga nagapugong sang PCx expression sa PNs nga kulang sa OXPHOS kag nagapauswag sang kamatayon sang selula, sa amo nagadula sang isa ka protective role (Figure 5F).
Sa sini nga pagtuon, naghatag kami sang ebidensya nga ang sabat sang PNs sa OXPHOS dysfunction amo ang amat-amat nga pagtingob sa TCA cycle atherosclerosis paagi sa differential activation pathway nga ginapahulag sang mga programa sa metabolismo. Ginkumpirma namon ang pag-analisar sang proteomic nga may madamo nga mga komplementaryo nga mga pamaagi kag ginpahayag nga kon ginahangkat sang grabe nga mitochondrial dysfunction, ang mga neuron may yara sang wala pa mahibal-an nga porma sang metaboliko nga pagkamaunat-unat. Sa amon kakibot, ang bug-os nga proseso sang pag-rewiring wala gid nagamarka sang terminal metabolic state nga nagaupod sa neurodegeneration sing amat-amat kag indi na mabalik, apang ang amon datos nagapakita nga mahimo ini magbug-os sang isa ka maintenance neuron bisan sa yugto antes sang kamatayon sang selula Functional compensation mechanism. Ini nga natukiban nagapakita nga ang mga neuron may daku nga kasangkaron sang metaboliko nga plasticity sa lawas. Ini nga kamatuoran nagapamatuod nga ang ulihi nga pagpakilala liwat sang MFN2 makabaliskad sang ekspresyon sang mga yabi nga mga marker sang metabolismo kag makapugong sang pagkaguba sang PN. Sa kabaliskaran, ginapunggan sini ang atherosclerosis kag ginapadasig ang mga nerbiyos. transsexual.
Ang isa sa pinakamakawiwili nga mga natukiban sa amon panalawsaw amo nga ang mga PN nga kulang sa OXPHOS makabag-o sang metabolismo sang siklo sang TCA paagi sa pag-up-regulate sang mga enzyme nga partikular nga nagapukaw sang arteriosclerosis. Ang metaboliko nga pag-areglo isa ka kinaandan nga bahin sang mga selula sang kanser, ang iban sini nagasalig sa glutamine sa pagdugang sang mga intermediate sang siklo sang TCA sa paghimo sang mga katumbas nga nagapanubo, nga nagamaneho sang respiratory chain kag nagamentinar sang produksyon sang lipid kag nucleotide biosynthesis precursors (39 , 40). Ang isa ka pagtuon sining karon lang nagpakita nga sa mga peripheral tissues nga naga-eksperyensya sang OXPHOS dysfunction, ang pag-angot liwat sang metabolismo sang glutamine/glutamate isa man ka prominente nga bahin (5, 41), sa diin ang direksyon sang pagsulod sang glutamine sa siklo sang TCA nagadepende sa Bangod sang kabug-at sang OXPHOS nga halit (41). ). Apang, kulang ang maathag nga ebidensya sa bisan ano nga pagkaanggid sang neuronal metabolic plasticity sa lawas kag ang posible nga kaangtanan sini sa konteksto sang balatian. Sa isa ka bag-o nga pagtuon sa vitro, ang mga panguna nga cortical neurons ginpakita nga nagapahulag sang mga glutamate pool para sa neurotransmission, sa amo nagapasanyog sang oxidative metabolism kag atherosclerosis sa idalom sang mga kondisyon sang metabolic stress (42). Dapat talupangdon nga sa idalom sang pharmacological inhibition sang TCA cycle enzyme succinate dehydrogenase, ang pyruvate carboxylation ginapatihan nga nagamentinar sang synthesis sang oxaloacetate sa cultured cerebellar granule neurons (34). Apang, ang pisiolohiko nga kaangtanan sining mga mekanismo sa tisyu sang utok (diin ang atherosclerosis ginapatihan nga panguna nga nalimitahan sa mga astrocyte) may importante gihapon nga pisiolohiko nga kahulugan (43). Sa sini nga kaso, ang amon datos nagapakita nga ang mga PN nga nahalitan sang OXPHOS sa lawas mahimo nga mabalhin sa BCAA degradation kag pyruvate carboxylation, nga amo ang duha ka panguna nga mga ginhalinan sang suplemento sang TCA pool intermediates. Bisan pa nga ang ginapatihan nga kontribusyon sang BCAA catabolism sa neuronal energy metabolism ginduso, dugang sa papel sang glutamate kag GABA para sa neurotransmission (44), wala gihapon sing ebidensya para sa sini nga mga mekanismo sa vivo. Gani, mahapos nga mag-espekulasyon nga ang mga dysfunctional PNs mahimo nga awtomatiko nga makabayad para sa pagkonsumo sang mga TCA intermediates nga ginatuytuyan sang proseso sang asimilasyon paagi sa pagdugang sang atherosclerosis. Sa partikular, ang pag-upregulate sang PCx mahimo nga kinahanglanon sa pagpadayon sang dugang nga demand para sa aspartic acid, nga ginapanugda sa nagadamo nga mga selula nga may mitochondrial dysfunction (45). Apang, ang amon pag-analisar sa metabolomics wala nagpakita sang bisan ano nga makahulugan nga mga pagbag-o sa steady-state nga lebel sang aspartic acid sa Mfn2cKO PNs (Figure S6A), nga ginapatihan nga nagapakita sang lainlain nga paggamit sang metaboliko sang aspartic acid sa tunga sang mga nagadamo nga mga selula kag mga post-mitotic neurons. Bisan pa ang eksakto nga mekanismo sang PCx upregulation sa dysfunctional neurons sa vivo nagapabilin nga makilala, ginpakita namon nga ining wala pa sa tion nga sabat may importante nga papel sa pagpadayon sang redox nga estado sang mga neuron, nga ginpakita sa mga eksperimento sang FLIM sa mga hiwa sang cerebellar. Sa partikular, ang pagpugong sa mga PN gikan sa pag-up-regulate sang PCx mahimo magdul-ong sa mas oxidized nga estado kag magpadasig sang kamatayon sang selula. Ang pagpaaktibo sang pagkaguba sang BCAA kag ang carboxylation sang pyruvate indi mga paagi sa pagkilala sang mga peripheral tissues sang mitochondrial dysfunction (7). Gani, daw isa sila ka prayoridad nga bahin sang mga neuron nga kulang sa OXPHOS, bisan pa indi lamang ang bahin, nga importante para sa neurodegeneration. .
Ang balatian sa utok isa ka heterogeneous nga sahi sang neurodegenerative nga balatian nga masami nagapakita subong ataxia kag masami nagahalit sa PNs (46). Ini nga populasyon sang neuron partikular nga madali mabiktima sang mitochondrial dysfunction bangod ang ila selective degeneration sa mga ilaga bastante na sa pagpatubas sang madamo nga mga sintomas sang motor nga nagapakilala sang human spinocerebellar ataxia (16, 47, 48). Suno sa mga report, ang isa ka transgenic nga modelo sang ilaga nga may mutant nga gene may kaangtanan sa human spinocerebellar ataxia kag may mitochondrial dysfunction (49, 50), nga nagapadaku sang importansya sang pagtuon sang mga resulta sang kakulangan sang OXPHOS sa PNPH. Gani, ini labi nga nagakabagay nga epektibo nga ma-isolate kag matun-an ining pinasahi nga populasyon sang neuron. Apang, bangod ang mga PN sensitibo gid sa pag-ipit kag nagabug-os sang manubo nga bahin sang bug-os nga populasyon sang selula sang cerebellar, para sa madamo nga pagtuon nga nakabase sa omics, ang pinili nga pagbulag sa ila subong bug-os nga mga selula isa gihapon ka makahalangkat nga aspeto. Bisan pa nga halos imposible nga malab-ot ang bug-os nga kakulang sang kontaminasyon sang iban nga mga sahi sang selula (ilabi na ang mga tisyu sang mga adulto), gintingob namon ang isa ka epektibo nga tikang sa dissociation upod sa FACS sa pagkuha sang bastante nga kadamuon sang mga viable neuron para sa pag-analisar sang proteomics sa idalom, kag may yara sang mataas nga coverage sang protina (mga 3000 ka protina) kon ipaanggid sa nagaluntad nga datos sang bug-os nga hugpong sang cerebel (15). Paagi sa pagpreserbar sang pagkamapuslanon sang bug-os nga mga selula, ang pamaagi nga amon ginahatag diri nagatugot sa amon indi lamang sa pag-usisa sang mga pagbag-o sa mga alagyan sang metabolismo sa mitochondria, kundi sa pag-usisa man sang mga pagbag-o sa iya mga katumbas sa cytoplasmic, nga nagakompleto sa paggamit sang mga tag sang membrane sang mitochondrial sa pagpauswag sang sahi sang selula Ang bag-o nga pamaagi para sa kadamuon sang mitochondria sa mga komplikado nga tisyu (2555). Ang pamaagi nga amon ginalaragway indi lamang may kaangtanan sa pagtuon sang mga selula sang Purkinje, kundi mahapos nga magamit sa bisan ano nga sahi sang selula sa pag-atubang sang mga pagbag-o sa metabolismo sa mga utok nga may balatian, lakip ang iban pa nga mga modelo sang mitochondrial dysfunction.
Sa katapusan, nakilala namon ang isa ka terapyutik nga bintana sa tion sining proseso sang pag-areglo liwat sang metabolismo nga makabalikid sing bug-os sang mga yabi nga senyales sang stress sa selula kag makapugong sang pagkaguba sang neuronal. Gani, ang paghangop sang mga implikasyon sa pag-obra sang pag-rewiring nga ginlaragway diri mahimo nga maghatag sang sadsaran nga mga panan-awan sa posible nga mga pagbulong para sa pagpadayon sang neuronal viability sa tion sang mitochondrial dysfunction. Ang palaabuton nga pagpanalawsaw nga nagatuyo sa pag-usisa sang mga pagbag-o sa metabolismo sang enerhiya sa iban nga mga sahi sang selula sang utok kinahanglanon agod bug-os nga mapahayag ang pagkaaplikar sini nga prinsipyo sa iban nga mga balatian sa utok.
Ang mga ilaga nga MitoPark ginlaragway na sang una (31). Ang C57BL/6N nga mga ilaga nga may loxP nga nagapalibot sa Mfn2 nga mga gene ginlaragway na sang una (18) kag gintabok sa L7-Cre nga mga ilaga (23). Ang resulta nga doble nga heterozygous nga kaliwat gin-cross sa homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP nga mga ilaga agud makahimo sang Purkinje-specific gene knockouts para sa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Sa isa ka subset sang pag-asawahay, ang Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) ginpakilala paagi sa dugang nga mga pagtabok (20). Ang tanan nga mga pamaagi sa sapat ginhimo suno sa mga pagsulundan sang Europa, pungsodnon kag institusyonal kag gin-aprobahan sang LandesamtfürNatur sang Umwelt kag Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany. Ang trabaho sa sapat nagasunod man sa giya sang European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Pagkatapos nga ma-anestisya ang cervical dislocation sang nagabusong nga babayi, ang mouse embryo gina-isolate (E13). Ang cortex gin-dissect sa Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) nga gindugangan sang 10 mM Hepes kag ginpasa sa Dulbecco's Modified Eagle's Medium nga may papain (20 U/ml) kag cysteine ​​(1μg/ml). I-incubate ang tissue sa DMEM) kag i-dissociate ini paagi sa enzymatic digestion. Ml) sa 37°C sa sulod sang 20 minutos, kag dayon mekanikal nga gingaling sa DMEM nga gindugangan sang 10% nga fetal bovine serum. Ang mga selula ginsab-ug sa mga coverslip nga bildo nga ginhaklapan sang polylysine sa densidad nga 2×106 kada 6 cm nga pinggan sang kultura ukon sa densidad nga 0.5×105 nga mga selula/cm2 para sa pag-analisar sang imaging. Pagkatapos sang 4 ka oras, ang medium gin-islan sang Neurobasal serum-free medium nga may 1% B27 supplement kag 0.5 mM GlutaMax. Ang mga neuron dayon ginmentinar sa 37°C kag 5% CO2 sa bug-os nga eksperimento, kag ginpakaon makaisa kada semana. Agod ma-induce ang recombination sa vitro, 3μl (24-well culture dish) ukon 0.5μl (24-well plate) sang masunod nga AAV9 virus vector ang gingamit sa pagbulong sang mga neuron sa ikaduha nga adlaw sa vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numero sang katalogo 105530-AAV9) kag AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numero sang katalogo 105545-AAV9).
Ang Mouse Mfn1 kag Mfn2 nga komplementaryo nga DNA (nga nakuha gikan sa Addgene plasmid #23212 kag #23213, sa magkatuhay) ginmarkahan sang V5 nga pagkasunod-sunod (GKPIPNPLLGLDST) sa C-terminus, kag gintingob sa mCherry sa frame paagi sa T2A nga pagkasunod-sunod. Ang Grx1-roGFP2 isa ka regalo gikan sa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Paagi sa pag-ilis sang tdTomato cassette gamit ang naandan nga mga pamaagi sa pag-clone, ang cassette gin-subclone sa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) agud makahimo sang pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 kag pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 nga mga vector. Ang kaanggid nga estratehiya gingamit sa paghimo sang control vector pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Agod makahimo sang AAV-shPCx nga konstruksyon, ang isa ka plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) kinahanglanon, nga nagaunod sang DNA sequence nga naga-encode sang shRNA nga nagapuntirya sa mouse PCx (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGACTTA 3′) Sa idalom sang kontrol sang U6 promoter, ang mCherry ginagamit sa idalom sang kontrol sang CMV promoter. Ang produksyon sang mga auxiliary AAV vectors ginhimo suno sa mga instruksyon sang manufacturer (Cell Biolabs). Sa malip-ot nga pulong, gamita ang isa ka transfer plasmid nga nagadala sang mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transiently Transfection of 29AV-MFN2-V5-MFN2-V5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ukon Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) nga naga-code nga gene, subong man naga-code sang AAV1 capsid protein kag accessory protein Packaging plasmid plasmid, gamit ang calcium phosphate nga pamaagi. Ang krudo nga virus supernatant nakuha paagi sa freeze-thaw cycles sa isa ka dry ice/ethanol bath kag lysed cells sa phosphate buffered saline (PBS). Ang AAV vector gintinluan paagi sa discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (24 ka oras sa 32,000 rpm kag 4°C) kag ginkonsentrar gamit ang Amicon ultra-15 centrifugal filter. Ang titer sang genome sang AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX amo ang ginlaragway sang una (dddddd GC/ml), paagi sa pagtakus sang realtime (PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) kag AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Ang mga panguna nga neuron gin-utod sa ice-cold 1x PBS, gin-pellet, kag dayon gin-homogenize sa 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer nga may phosphatase kag protease inhibitor (Roche). Ang pag-isip sang protina ginhimo paagi sa paggamit sang bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Ang mga protina dayon ginseparar paagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, kag dayon gin-blot sa isa ka polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). I-block ang mga indi espesipiko nga mga lugar kag i-incubate upod ang panguna nga antibody (tan-awa ang Table S1 para sa mga detalye) sa 5% nga gatas sa TBST (Tris-buffered saline nga may Tween), mga tikang sa paghugas kag ikaduha nga antibody sa TBST Incubate. I-incubate ang panguna nga antibody sa bilog nga gab-i sa +4°C. Pagkatapos mahugasan, ibutang ang ikaduha nga antibody sa sulod sang 2 ka oras sa temperatura sang kwarto. Pagkatapos, paagi sa pag-incubate sang amo man nga blot nga may anti-β-actin antibody, ang amo man nga loading nakumpirma. Pagtukib paagi sa pag-convert sa chemiluminescence kag pagpauswag sang chemiluminescence (GE Healthcare).
Ang mga neuron nga gin-seed sang una sa mga glass coverslips gin-ayo gamit ang 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS sa gintalana nga oras sa temperatura sang kwarto sa sulod sang 10 minutos. Ang mga coverslip una nga ginabutangan sang 0.1% Triton X-100/PBS sa sulod sang 5 minutos sa temperatura sang kwarto, kag dayon sa blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Sa ikaduha nga adlaw, ang mga coverslip ginhugasan gamit ang blocking buffer kag gin-incubate gamit ang nagakaigo nga fluorophore-conjugated secondary antibody sa sulod sang 2 ka oras sa temperatura sang kwarto; sa katapusan, ang mga sample ginhugasan sing maayo sa PBS nga may 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) nga gin-counterstain kag dayon gin-ayo sa microscope slide gamit ang Aqua-Poly/Mount.
Ang mga ilaga (lalaki kag babayi) gin-anestisya paagi sa intraperitoneal injection sang ketamine (130 mg/kg) kag xylazine (10 mg/kg) kag ginhatag sa idalom sang panit nga may carprofen analgesic (5 mg/kg) , Kag ginbutang sa isa ka stereotactic nga instrumento (Kopf) nga may warm. Ibuyagyag ang kalabera kag gamita ang dental drill sa pagpanipis sang bahin sang cerebellar cortex nga katumbas sa mis bone (gikan sa lambda: ikog 1.8, lateral 1, katumbas sa lobules IV kag V). Gamita ang kurbado nga dagom sang hiringgilya sa paghimo sing maayo sang gamay nga buho sa kalabera agod malikawan ang pagtublag sa vasculature sa idalom. Dayon ang manipis nga ginguyod nga bildo nga capillary amat-amat nga ginasulod sa micro-hole (halin sa -1.3 tubtob -1 sa ventral nga bahin sang dura mater), kag 200 tubtob 300 nl AAV ang gina-indyeksion sa micro-injector (Narishige) gamit ang manual syringes (Narishige) sing pila ka beses sa manubo nga presyon sa sulod sang 20 minutos tubtob 20 minutos. Pagkatapos sang pagtughong, ibutang ang capillary sa sulod sang 10 pa ka minutos agud tugutan ang virus nga maglapta sing bug-os. Pagkatapos nga makuha ang mga capillary, ang panit ginatahi sing maayo agod mapahaganhagan ang pagpanghubag sang pilas kag tugutan ang sapat nga mag-ayo. Ang mga sapat ginbulong sang mga analgesics (caspofen) sa sulod sang pila ka adlaw pagkatapos sang operasyon, sa diin ang ila pisikal nga kahimtangan ginbantayan sing maayo kag dayon gin-euthanize sila sa ginsambit nga tion. Ang tanan nga mga pamaagi ginhimo suno sa mga pagsulundan sang Europa, pungsodnon kag institusyonal kag gin-aprobahan sang LandesamtfürNatur sang Umwelt kag Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany.
Ang mga sapat gin-anestisya sang ketamine (100 mg/kg) kag xylazine (10 mg/kg), kag ang tagipusuon gin-perfuse sang 0.1 M PBS una, kag dayon sang 4% PFA sa PBS. Ang tisyu gin-utod kag gin-ayo sa 4% PFA/PBS sa bilog nga gab-i sa 4°C. Ang isa ka nagatiyog nga kutsilyo (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) gingamit sa paghanda sang mga seksyon sang sagittal (50 μm ang kadamulon) gikan sa natakda nga utok sa PBS. Luwas kon may iban nga ginsambit, ang pagmantsa sang mga seksyon nga nagalutaw nga hilway ginhimo suno sa ginlaragway sa ibabaw (13) sa temperatura sang kwarto kag pag-uyog. Sa malip-ot nga pulong, una, ang nakuha nga mga hiwa gin-permeabilize gamit ang 0.5% Triton X-100/PBS sa sulod sang 15 minutos sa temperatura sang kwarto; para sa pila ka mga epitopes (Pcx kag Shmt2), paagi sa tris-EDTA buffer sa 80°C (PH 9) initon ang mga hiwa sa sulod sang 25 minutos sa baylo sini nga tikang. Masunod, ang mga seksyon gin-incubate upod ang panguna nga antibody (tan-awa ang Table S1) sa blocking buffer (3% BSA/PBS) sa 4°C sa bug-os nga gab-i nga may pag-uyog. Pagkasunod nga adlaw, ang mga seksyon ginhugasan gamit ang blocking buffer kag gin-incubate gamit ang nagakaigo nga fluorophore-conjugated secondary antibody sa sulod sang 2 ka oras sa temperatura sang kwarto; sa katapusan, ang mga seksyon ginhugasan sing maayo sa PBS, gin-counter-stained gamit ang DAPI, kag dayon gin-ayo gamit ang AquaPolymount Sa isa ka slide sang mikroskopyo.
Ang laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X ukon TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) nga may white light laser kag 405 diode ultraviolet laser ang gingamit sa pag-imahe sang sample. Paagi sa pag-excite sang fluorophore kag pagtipon sang signal gamit ang Hybrid Detector (HyDs), ang LAS-X software gingamit sa pagtipon sang mga stacked nga mga laragway nga nagasunod sa Nyquist sampling sa sequential mode: para sa mga non-quantitative nga mga panel, ini ang highly dynamic nga mga signal (halimbawa, sa somatic cells kag dendrites) mtY FPD to Hybrid Detector sa tuo nga numero sang detect sang BPNRs mode). Ang pag-gate halin sa 0.3 tubtob 6 ns ginagamit sa pagnubo sang background.
Real-time nga pag-imahe sang mga gin-sort nga mga selula. Pagkatapos sang pag-sort sa Neurobasal-A medium nga nagaunod sang 1% B27 supplement kag 0.5 mM GlutaMax, ang mga selula gilayon nga ginsab-ug sa poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) , Kag dayon gintipigan ini sa 37°C kag 25% CO sa sulod sang isa ka oras agud matugutan ang selula magpuyo. Ang real-time imaging ginhimo sa isa ka Leica SP8 laser scanning confocal microscope nga may puti nga laser, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens kag isa ka heating stage.
Ang ilaga madasig nga gin-anestisya gamit ang carbon dioxide kag gin-utod ang ulo, ang utok madasig nga ginkuha gikan sa kalabera, kag gin-utod sa 200μm nga kadamulon (para sa 13C nga eksperimento sa pagmarka) ukon 275μm nga kadamulon (para sa duha ka eksperimento sa photon) sagittal nga seksyon nga puno sang masunod nga mga materyales Ang ice cream (HM-605, VHer, Scientific Walldorf, Germany) puno sang masunod nga mga substansiya: 125 mM ice-cold, carbon-saturated (95% O2 kag 5% CO2) manubo nga Ca2 + artificial cerebrospinal fluid (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, NaCl 2.5 mM, 25 mM gluse 0.5 mM CaCl2 kag 3.5 mM MgCl2 (osmotic pressure nga 310 tubtob 330 mmol). Isaylo ang nakuha nga mga hiwa sang utok sa isa ka pre-incubation chamber nga nagaunod sang mas mataas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Cl kag 20 mM. MgCl2) Medium) pH 7.4 kag 310 tubtob 320 mmol).
Sa tion sang proseso sang pag-imaging, ang mga hiwa ginsaylo sa isa ka dedikado nga hulot sa pag-imahe, kag ang eksperimento ginhimo sa idalom sang padayon nga ACSF perfusion sa isa ka dalayon nga temperatura nga 32° tubtob 33°C. Ang multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) nga may Leica 25x objective lens (NA 0.95, tubig), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ang gingamit para sa slice imaging. FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM sang Grx1-roGFP2. Ang mga pagbag-o sa cytoplasmic redox state sang PNs gintakus paagi sa two-photon FLIM sa sagittal brain slices, sa diin ang Grx1-roGFP2 biosensor nagpuntirya sa PNs. Sa PN layer, ang acquisition field ginapili mga 50 tubtob 80 μm sa idalom sang slice surface agud masiguro nga may yara sang isa ka viable PN (nga amo, ang kakulang sang beaded structure ukon neuronal morphological changes sa mga dendrites) kag ang doble nga positibo nga roGFP2 sensor kag AAV nga naga-encode sang shRNA PCx ukon ang iya pagkontrol sang sequence (pagkontrol sang mCherry coexpressing). Magtipon sang mga laragway nga may isa ka stack nga may 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Deteksyon: internal HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] kag image averaging sa sulod sang 2 tubtob 3 ka minutos ang ginagamit sa pagsiguro nga bastante nga mga photon ang nakolekta (1000 ka photon sa kabug-usan) para sa curve fitting. Ang pagkasensitibo sang Grx1-roGFP2 probe kag ang pag-usisa sang mga kondisyon sang FLIM ginhimo paagi sa pagbantay sang bili sang kalawigon sang kabuhi sang roGFP2 kon ginadugangan ang exogenous 10 mM H2O2 sa perfusion ACSF (agod mapataas ang oksihenasyon, nga nagaresulta sa pagdugang sang kalawigon sang kabuhi), kag dayon pagdugang sang 2 mM dithiothreit (nagaresulta sa pagnubo sang kadakuon sang pagnubo, pagnubo sang kalawigon sang kabuhi) (Figure S8, D tubtob G). Gamita ang FLIMfit 5.1.1 software sa pag-analisar sang nakuha nga mga resulta, i-fit ang single exponential decay curve sang bug-os nga laragway sa gintakus nga IRF (instrument response function), kag ang χ2 ginabanta nga 1. Sa pagkalkulo sang kabuhi sang isa ka PN, ang maskara sa palibot sang lawas sang nerbiyos gindrowing sing mano-mano, kag ang average nga kabuhi para sa tagsa ka mask gingamit.
Pag-analisar sang potensyal sang mitochondrial. Pagkatapos nga ang acute section gin-incubate nga may 100 nM TMRM nga direkta nga gindugang sa perfused ACSF sa sulod sang 30 minutos, ang mga pagbag-o sa potensyal sang mitochondrial sang PNs gintakus paagi sa two-photon microscope. Ang TMRM imaging ginhimo paagi sa pag-excite sang probe sa 920 nm kag paggamit sang internal HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) sa pagtipon sang mga signal; paagi sa paggamit sang pareho nga excitation wavelength apang nagagamit sang lain nga internal HyD (FITC :525/50) sa pag-imahe sang mtYFP. Gamita ang ImageJ's Image Calculator plug-in sa pag-ebalwar sang potensyal sang mitochondrial sa lebel sang isa ka selula. Sa malip-ot nga pulong, ang plug-in equation: signal = min (mtYFP, TMRM) ginagamit sa pagkilala sang mitochondrial region nga nagapakita sang TMRM signal sa Purkinje Somali sa single-stack confocal image sang katumbas nga channel. Dayon ang pixel area sa resulta nga maskara gina-quantify, kag dayon gina-normalize sa katumbas nga threshold single-stack image sang mtYFP channel agud makuha ang mitochondrial fraction nga nagapakita sang mitochondrial potential.
Ang laragway gin-deconvolute gamit ang Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Para sa mga gin-scan nga mga laragway sang mga tile, ang montage sang isa ka tile ginahimo gamit ang automatic stitching algorithm nga ginhatag sang LAS-X software. Pagkatapos sang pag-calibrate sang laragway, gamita ang ImageJ kag Adobe Photoshop sa dugang nga pagproseso sang laragway kag uniporme nga pag-adjust sang kasanag kag kontras. Gamita ang Adobe Illustrator para sa paghanda sang graphic.
mtDNA focus analysis. Ang kadamuon sang mga samad sang mtDNA gin-isip sa mga seksyon sang cerebellar nga may mga antibodies batok sa DNA paagi sa confocal microscope. Ang tagsa ka target nga lugar ginhimo para sa lawas sang selula kag ang nucleus sang tagsa ka selula, kag ang tagsa ka lugar ginkalkulo gamit ang Multi Measure plug-in (ImageJ software). Ibuhin ang nukleyar nga lugar gikan sa lugar sang lawas sang selula agud makuha ang cytoplasmic area. Sa katapusan, ang Analyze Particles plug-in (ImageJ software) gingamit sa awtomatiko nga pag-isip sang mga punto sang cytoplasmic DNA nga nagapakita sang mtDNA sa threshold image, kag ang nakuha nga mga resulta gin-normalize sa PN average sang CTRL nga mga ilaga. Ang mga resulta ginapabutyag subong ang promedyo nga kadamuon sang mga nucleoside kada selula.
Pag-analisar sang ekspresyon sang protina. Gamita ang ImageJ's Image Calculator plug-in sa pag-ebalwar sang ekspresyon sang protina sa PN sa lebel sang isa ka selula. Sa malip-ot nga pulong, sa single-layer confocal image sang katumbas nga channel, paagi sa equation: signal = min (mtYFP, antibody), ang mitochondrial region nga nagapakita sang immunoreactivity sa isa ka antibody sa Purkina nakilala. Dayon ang pixel area sa resulta nga maskara gina-quantify, kag dayon gina-normalize sa katumbas nga threshold single-stack image sang mtYFP channel agud makuha ang mitochondrial fraction sang ginapakita nga protina.
Pag-analisar sang densidad sang selula sang Purkinje. Ang Cell Counter plug-in sang ImageJ gingamit sa pag-ebalwar sang Purkinje density paagi sa pagbahin sang kadamuon sang mga selula sang Purkinje nga gin-isip sa kalabaon sang cerebellar ring nga gina-okupar sang gin-isip nga mga selula.
Paghanda kag pagkolekta sang sample. Ang mga utok gikan sa grupo sang kontrol kag Mfn2cKO nga mga ilaga gin-ayo sa 2% PFA/2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M phosphate buffer (PB), kag dayon ang mga seksyon sang coronal ginhanda gamit ang mga ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Kadamol 50 tubtob 60) Ang fix buffer sa 1% PB tetraoxide kag 1.5% potassium ferrocyanide sa temperatura sang kwarto sa sulod sang 1 ka oras. Ang mga seksyon ginhugasan sing tatlo ka beses gamit ang distilled water, kag dayon gin-stain sang 70% ethanol nga may 1% uranyl acetate sa sulod sang 20 minutos. Ang mga seksyon dayon gin-dehydrate sa graded alcohol kag ginsulod sa Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) sa tunga sang silicon-coated glass slides, kag sa katapusan sa 60°C Polymerize sa oven sa sulod sang 48 ka oras. Ang lugar sang cerebellar cortex ginpili kag ang 50 nm nga ultrathin nga mga seksyon gin-utod sa Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) kag ginpili sa 2×1 mm nga copper slit grid nga ginhaklapan sang polystyrene film. Ang mga seksyon ginmantsahan sang solusyon sang 4% uranyl acetate sa H2O sa sulod sang 10 minutos, ginhugasan sang H2O sing pila ka beses, dayon sang Reynolds lead citrate sa H2O sa sulod sang 10 ka minutos, kag dayon ginhugasan sang H2O sing pila ka beses. Ang mga mikrograpo ginkuha gamit ang transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gamit ang TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Alemanya).
Para sa mga ilaga nga natapikan sang AAV, ang utok ginseparar kag gin-utod sa 1 mm nga kadamulon nga sagittal section, kag ang cerebellum gin-usisa gamit ang fluorescence microscope sa pagkilala sang AAV-infected ring (nga amo, mCherry expressing). Ang mga eksperimento lamang sa diin ang AAV injection nagaresulta sa mataas gid nga transduction efficiency sang Purkinje cell layer (ie halos ang bug-os nga layer) sa indi magkubos sa duha ka sunod-sunod nga cerebellar rings ang ginagamit. Ang AAV-transduced loop gin-microdissect para sa overnight post-fixation (4% PFA kag 2.5% glutaraldehyde sa 0.1 M cocoate buffer) kag ginproseso pa gid. Para sa EPON embedding, ang fixed tissue ginhugasan gamit ang 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), kag gin-incubate gamit ang 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) sa 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) 4 ka oras, dayon ginhugasan sa sulod sang 2 ka oras. Balika sing 3 ka beses gamit ang 0.1 M cocamide buffer. Pagkatapos, ang nagasaka nga serye sang ethanol gingamit sa pag-incubate sang tagsa ka solusyon sang ethanol sa 4°C sa sulod sang 15 minutos agud ma-dehydrate ang tisyu. Ang tisyu ginsaylo sa propylene oxide kag gin-incubate sa bilog nga gab-i sa EPON (Sigma-Aldrich) sa 4°C. Ibutang ang tisyu sa preska nga EPON sa temperatura sang kwarto sa sulod sang 2 ka oras, kag dayon ibutang ini sa 62°C sa sulod sang 72 ka oras. Gamita ang ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) kag diamond knife (Diatome, Biel, Switzerland) sa pag-utod sang 70 nm nga ultrathin nga mga seksyon, kag mantsahan sang 1.5% uranyl acetate sa sulod sang 15 minutos sa 37°C, kag mantsahan sang lead citrate solution 4 minutos. Ang mga electron micrographs ginkuha gamit ang JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) nga may Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) kag DigitalMicrograph software (Gatan). Para sa pag-analisar, ang mga electron micrographs nakuha gamit ang 5000× ukon 10,000× digital zoom.
Pag-analisar sang morpolohiya sang mitochondria. Para sa tanan nga mga pag-analisar, ang mga contour sang indibidwal nga mitochondria ginbalay sa digital nga mga laragway gamit ang ImageJ software. Ang nagkalainlain nga mga parameter sa morpolohiya gi-analisar. Ang densidad sang mitochondria ginapabutyag bilang porsyento nga nakuha paagi sa pagbahin sang kabug-usan nga mitochondrial area sang tagsa ka selula paagi sa cytoplasm area (cytoplasm area = cell area-cell nucleus area) × 100. Ang pagkabilog sang mitochondria ginakalkulo paagi sa pormula [4π∙(area/perimeter 2)]. Ang ista morpolohiya sang mitochondria gin-analisar kag gintunga sa duha ka kategoriya ("tubular" kag "blister") suno sa ila panguna nga mga korte.
Pag-analisar sang numero kag densidad sang autophagosome/lysosome. Gamita ang ImageJ software sa pag-outline sang mga contour sang tagsa ka autophagosome/lysosome sa digital nga laragway. Ang autophagosome/lysosome area ginapabutyag bilang porsyento nga ginkalkulo paagi sa pagbahin sang kabug-usan nga autophagosome/lysosome structure area sang tagsa ka selula paagi sa cytoplasm area (cytoplasm area=cell area-nucleus area)×100. Ang densidad sang mga autophagosome/lysosomes ginakalkulo paagi sa pagbahin sang kabug-usan nga numero sa kadamuon sang mga istruktura sang autophagosome/lysosome kada selula (sa mga termino sang cytoplasmic area) (cytoplasmic area = cell area-nuclear area).
Pagmarka para sa acute sectioning kag paghanda sang sample. Para sa mga eksperimento nga nagakinahanglan sang glucose labeling, ibalhin ang mga acute brain slices sa isa ka pre-incubation chamber, nga nagaunod sang saturated carbon (95% O2 kag 5% CO2), mataas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 2.5 mM MM NaCl, 1.25 mM NaCl. d-glucose, 1.0 mM CaCl 2 kag 2.0 mM MgCl 2, nga gin-adjust sa pH 7.4 kag 310 tubtob 320 mOsm), sa diin ang glucose amo ang 13 C 6- Glucose substitution (Eurisotop, catalog number CLM-1396). Para sa mga eksperimento nga nagakinahanglan sang pyruvate labeling, ibalhin ang mga acute brain slices sa mas mataas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Ml kag Add. MgCl2, i-adjust sa pH 7.4 kag 310 sa 320mOsm), kag idugang ang 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, numero sang katalogo CLM-1082). I-incubate ang mga seksyon sa sulod sang 90 minutos sa 37°C. Sa katapusan sang eksperimento, ang mga seksyon madasig nga ginhugasan gamit ang isa ka tubigon nga solusyon (pH 7.4) nga nagaunod sang 75 mM ammonium carbonate, kag dayon gin-homogenize sa 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: tubig. Pagkatapos nga ang mga seksyon gin-incubate sa yelo sa sulod sang 30 minutos, ang mga sample gin-centrifuge sa 21,000 g sa sulod sang 10 minutos sa 4°C, kag ang matin-aw nga supernatant ginpamala sa isa ka SpeedVac concentrator. Ang resulta nga uga nga metabolite pellet gintago sa -80°C tubtob sa pag-analisar.
Liquid chromatography-mass spectrometry analysis sang 13 C-labeled amino acids. Para sa pag-analisar sang liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), ang metabolite pellet gin-resuspend sa 75μl sang LC-MS grade water (Honeywell). Pagkatapos sang centrifugation sa 21,000 g sa sulod sang 5 minutos sa 4°C, 20 μl sang ginklaro nga supernatant ang gingamit para sa amino acid flux analysis, samtang ang nabilin nga extract gilayon nga gingamit para sa anion analysis (tan-awa sa idalom). Ang pag-analisar sang amino acid ginhimo gamit ang ginlaragway na nga benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56). Sa una nga tikang, 10μl sang 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) ang gindugang sa 20μl sang metabolite extract, kag dayon 10μl sang 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ang gindugang sa LC grade ACN. Ang sample gin-vortex sing makadali kag dayon gin-centrifuge sa 21,000 g sa sulod sang 5 minutos sa 20°C. Isaylo ang gintinluan nga supernatant sa 2 ml nga autosampler vial nga may conical glass insert (200 μl nga kadamuon). Ang mga sample gin-analisar gamit ang Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) nga konektado sa Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Para sa pag-analisar, 2μl sang ginkuha nga sample ang gin-inject sa 100×1.0 mm nga high-strength silica T3 column (Waters) nga may 1.8μm nga mga partikulo. Ang kadasigon sang pag-ilig 100μl/min, kag ang sistema sang buffer ginabug-usan sang buffer A (10 mM ammonium formate kag 0.15% formic acid sa tubig) kag buffer B (ACN). Ang gradient amo ang masunod: 0%B sa 0 minutos; 0%B. 0 tubtob 15% B sa 0 tubtob 0.1 ka minuto; 15 tubtob 17% B sa 0.1 tubtob 0.5 ka minutos; B sa 17 tubtob 55% sa 0.5 tubtob 14 ka minutos; B sa 55 tubtob 70% sa 14 tubtob 14.5 ka minutos; sa 14.5 tubtob 70 tubtob 100% B sa 18 minutos; 100% B sa 18 tubtob 19 ka minutos; 100 tubtob 0% B sa 19 tubtob 19.1 ka minutos; 0% B sa 19.1 tubtob 28 minutos (55, 56). Ang QE-HF mass spectrometer naga-operate sa positibo nga ionization mode nga may mass range nga m/z (mass/charge ratio) nga 50 tubtob 750. Ang gin-apply nga resolusyon amo ang 60,000, kag ang gain control (AGC) ion target nga nakuha amo ang 3×106, kag ang maximum ion time amo ang 10 milliseconds. Ang nainit nga electrospray ionization (ESI) nga ginhalinan naga-operate sa isa ka spray voltage nga 3.5 kV, isa ka capillary temperature nga 250°C, isa ka sheath airflow nga 60 AU (arbitrary units), kag isa ka auxiliary airflow nga 20 AU. 250°C. Ang S lens ginbutang sa 60 AU.
Anion chromatography-MS analysis sang 13C nga may marka nga organiko nga mga asido. Ang nabilin nga metabolite precipitate (55μl) gin-analisar gamit ang Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) nga konektado sa QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Sa malip-ot nga pulong, 5μl sang metabolite extract ang gin-indyeksion sa isa ka Dionex IonPac AS11-HC nga haligi nga may HPLC (2 mm×250 mm, kadakuon sang partikulo 4μm, Thermo Fisher Scientific) sa push-in partial loop mode nga may filling ratio nga 1. ) Dionex IonPac AG11-HC mm guard column ( x 4μm, Thermo Fisher Scientific). Ang temperatura sang haligi ginahuptan sa 30°C, kag ang autosampler ginabutang sa 6°C. Gamita ang potassium hydroxide cartridge nga may deionized nga tubig sa paghimo sang potassium hydroxide gradient paagi sa eluent generator. Pagbulag sang mga metabolite sa kadasigon sang pag-ilig nga 380μl/min, nga naga-apply sang masunod nga gradient: 0 tubtob 3 ka minutos, 10 mM KOH; 3 tubtob 12 ka minutos, 10 tubtob 50 mM KOH; 12 tubtob 19 ka minutos, 50 tubtob 100 mM KOH; 19 tubtob 21 ka minutos, 100 mM KOH; 21 tubtob 21.5 ka minutos, 100 tubtob 10 mM KOH. Ang haligi gin-equilibrate liwat sa idalom sang 10 mM KOH sa sulod sang 8.5 minutos.
Ang mga eluted metabolites ginatingob sa 150μl/min isopropanol supplement stream pagkatapos sang haligi kag dayon ginatuytuyan sa isa ka high-resolution mass spectrometer nga naga-operate sa negatibo nga ionization mode. Ginabantayan sang MS ang mass range halin sa m/z 50 tubtob 750 nga may resolusyon nga 60,000. Ang AGC ginbutang sa 1×106, kag ang pinakamataas nga oras sang ion gintipigan sa 100 ms. Ang nainit nga ESI source gin-operate sa spray voltage nga 3.5 kV. Ang iban pa nga mga setting sang ion source amo ang masunod: temperatura sang capillary 275°C; sheath gas flow, 60 AU; auxiliary gas flow, 20 AU sa 300°C, kag S lens setting sa 60 AU.
Pag-analisar sang datos sang 13C nga may marka nga mga metabolite. Gamita ang TraceFinder software (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific) para sa pag-analisar sang datos sang isotope ratio. Ang identidad sang tagsa ka compound ginpamatud-an sang isa ka masaligan nga reperensya nga compound kag gin-analisar sing independiente. Agod mahimo ang pag-analisar sang pagpauswag sang isotope, ang lugar sang ginkuha nga ion chromatogram (XIC) sang tagsa ka 13C isotope (Mn) ginkuha gikan sa [M + H] +, sa diin ang n amo ang numero sang carbon sang target nga compound, nga ginagamit sa pag-analisar sang mga amino acid ukon [ MH] + ginagamit sa pag-analisar sang mga anion. Ang katukma sang masa sang XIC kubos sa lima ka bahin kada milyon, kag ang katukma sang RT 0.05 minutos. Ang pag-analisar sang pagpauswag ginahimo paagi sa pagkalkulo sang ratio sang tagsa ka natukiban nga isotope sa kabug-usan sang tanan nga mga isotope sang katumbas nga compound. Ini nga mga ratio ginahatag bilang porsyento nga mga balor para sa tagsa ka isotope, kag ang mga resulta ginapabutyag bilang molar porsyento nga pagpauswag (MPE), subong sang ginlaragway na (42).
Ang nagyelo nga neuron pellet gin-homogenize sa ice-cold 80% methanol (v/v), gin-vortex, kag gin-incubate sa -20°C sa sulod sang 30 minutos. I-vortex liwat ang sample kag pukawon sa +4°C sa sulod sang 30 minutos. Ang sample gin-centrifuge sa 21,000 g sa sulod sang 5 minutos sa 4°C, kag dayon ang resulta nga supernatant gintipon kag ginpamala gamit ang SpeedVac concentrator sa 25°C para sa masunod nga pag-analisar. Subong sang ginlaragway sa ibabaw, ang pag-analisar sang LC-MS ginhimo sa mga amino acid sang mga gin-sort nga mga selula. Gamit ang TraceFinder (bersyon 4.2, Thermo Fisher Scientific), ang pag-analisar sang datos ginhimo gamit ang monoisotopic mass sang tagsa ka compound. Ang quantile normalization sang datos sang metabolite ginhimo gamit ang preprocessCore software package (57).
Pag-andam sa hiwa. Ang ilaga madasig nga gin-anestisya gamit ang carbon dioxide kag gin-utod ang ulo, ang utok madasig nga ginkuha gikan sa kalabera, kag ang ice-filled vibrating knife (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) gingamit sa pag-utod sini sa 300 tubtob 375 μm sagittal sections sang carbon dioxide (25% O) kag CO Manubo nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 kag 6.0 mM MgCl2 I-adjust sa pH 37 kag 30 mM). Isaylo ang nakuha nga mga hiwa sang utok sa isa ka hulot nga may mas mataas nga Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mMl Ca 2.2 mM kag 5 MM pH 7.4 kag 310 tubtob 320 mOsm). Ibutang ang mga hiwa sa sulod sang 20 tubtob 30 minutos agud nga mabalik ini antes magrekord.
pagrekord. Ang isa ka entablado sang mikroskopyo nga may isa ka fixed recording chamber kag isa ka 20x water immersion objective lens (Scientifica) ang gingamit para sa tanan nga mga pagrekord. Ang mga putative Purkinje cells ginkilala paagi sa (i) kadakuon sang lawas, (ii) anatomical nga lokasyon sang cerebellum, kag (iii) ekspresyon sang fluorescent mtYFP reporter gene. Ang patch pipette nga may tip resistance nga 5 tubtob 11 megohms ginaguyod sang borosilicate glass capillary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) kag isa ka horizontal pipette Instruments (P-10000), Sutter, CA). Ang tanan nga mga pagrekord ginhimo sang ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), nga ginkontrol sang software Signal (bersyon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Ang eksperimento ginrekord sa sampling rate nga 12.5 kHz. Ang signal ginasala paagi sa duha ka short-pass Bessel filter nga may cutoff frequency nga 1.3 kag 10 kHz. Ang kapasidad sang membrane kag sang pipette ginabayaran sang sirkito sang bayad gamit ang amplifier. Ang tanan nga mga eksperimento ginhimo sa idalom sang kontrol sang Orca-Flash 4.0 nga kamera (Hamamatsu, Gerden, Germany), nga ginkontrol sang Hokawo software (bersyon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany).
Rutina nga pag-configure kag pag-analisar sang bug-os nga selula. Antes gid magrekord, pun-a ang pipette sang internal nga solusyon nga nagaunod sang masunod nga mga substansiya: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (M0 mM), 5 MM Gusiphate. (GTP) (Na) kag 10.0 mM creatinine phosphate gin-adjust sa pH 7.25, kag ang osmotic pressure 290 mOsm (sucrose). Sa gilayon pagkatapos sang pag-apply sang pwersa nga 0 pA sa pag-utod sang membrane, ang nagapahuway nga potensyal sang membrane gintakus. Ang input resistance ginatakus paagi sa pag-apply sang hyperpolarized currents sang -40, -30, -20, kag -10 pA. Takusa ang kadakuon sang sabat sang boltahe kag gamita ang kasuguan ni Ohm sa pagkalkulo sang resistensya sang input. Ang kinaugalingon nga aktibidad ginrekord sa isa ka boltahe nga clamp sa sulod sang 5 minutos, kag ang sPSC ginkilala kag gintakus sa Igor Pro (bersyon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) gamit ang isa ka semi-automatic recognition script. Ang IV curve kag steady-state current ginatakus paagi sa pag-clamp sang baterya sa nagkalainlain nga mga potensyal (sugod sa -110 mV) kag pagdugang sang boltahe sa 5 mV nga mga tikang. Ang produksyon sang AP gintestingan paagi sa pag-apply sang depolarizing current. I-clamp ang cell sa -70 mV samtang naga-apply sang depolarizing current pulse. I-adjust ang kadakuon sang tikang sang tagsa ka yunit sang pagrekord sing separado (10 tubtob 60 pA). Kalkulaha ang pinakamataas nga frequency sang AP paagi sa mano-mano nga pag-isip sang mga spike sang pulso nga nagatuga sang pinakamataas nga frequency sang AP. Ang AP threshold gina-analisar paagi sa paggamit sang ikaduha nga derivative sang depolarization pulse nga una nga naga-trigger sang isa ukon kapin pa nga APs.
Pag-configure kag pag-analisar sang perforated patch. Himua ang perforated patch recording gamit ang mga sulundan nga protocol. Maggamit sang ATP- kag GTP-free pipette nga wala nagaunod sang masunod nga mga sangkap: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA kag 2 mM MgCl2, kag i-adjust sa pH 7.2 (gamit ang KOH). Ang ATP kag GTP wala ginalakip sa intracellular nga solusyon agud malikawan ang indi makontrol nga pagkamasulud sang membrane sang selula. Ang patch pipette ginapuno sang isa ka amphotericin-containing internal solution (ginabanta 200 tubtob 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) agud makakuha sang isa ka punched patch record. Ang amphotericin gintunaw sa dimethyl sulfoxide (katapusan nga konsentrasyon: 0.1 tubtob 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ang konsentrasyon sang DMSO nga gingamit wala sing daku nga epekto sa mga neuron nga gintun-an. Sa tion sang proseso sang pagsuntok, ang resistensya sang channel (Ra) padayon nga ginbantayan, kag ang eksperimento ginsugdan pagkatapos nga ang amplitude sang Ra kag AP nag-establisar (20-40 minutos). Ang kinaugalingon nga aktibidad ginatakus sa isa ka boltahe kag/ukon koryente nga clamp sa sulod sang 2 tubtob 5 ka minutos. Ang pag-analisar sang datos ginhimo gamit ang Igor Pro (bersyon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (bersyon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) kag GraphPad Prism (bersyon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estados Unidos). Agod makilala ang mga kinaugalingon nga AP, ginagamit ang NeuroMatic v3.0c plug-in sang IgorPro. Awtomatiko nga makilala ang mga AP gamit ang ginhatag nga threshold, nga gina-adjust sing indibiduwal para sa tagsa ka rekord. Gamit ang spike interval, hibalua ang spike frequency nga may pinakamataas nga instantaneous spike frequency kag ang average nga spike frequency.
PN nga pag-isahanon. Paagi sa pagpasibu sa nauna nga ginbalhag nga protocol, ang mga PNs gintinluan gikan sa cerebellum sang ilaga sa isa ka natumod nga yugto (58). Sa malip-ot nga pulong, ang cerebellum gin-dissect kag gin-mince sa ice-cold dissociation medium [nga wala sing HBSS Ca2+ kag Mg2+, nga gindugangan sang 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) kag streptomycin (0.05 mg/ ml)], kag dayon gintunaw ang medium sa papain [HBSS, HCS-supplemented nga may HCS-steine (1 mg / ml), papain (16 U / ml) kag deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Bulong sa sulod sang 30 minutos sa 30°C. Una hugasi ang mga tisyu sa HBSS medium nga may egg mucus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) kag DNase (0.1 mg/ml) sa temperatura sang kwarto agud malikawan ang enzymatic digestion, kag dayon sa HBSS medium nga may 20 mM glucose Mahinay nga paggaling sa HBSS peillinic, strepliny/ml/ml (0.05 mg/ml) kag DNase (0.1 mg/ml) nagapaguwa sang isa ka selula. Ang resulta nga suspension sang selula ginsala paagi sa 70μm nga cell strainer, dayon ang mga selula gin-pellet paagi sa centrifugation (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) kag gin-resuspended sa sorting medium [HBSS, nga gindugangan sang 20 mM glucose, 20% fetal bovine ) Serum, pelinic (50) kag stremcylin (0.05 mg/ml)]; tan-awa ang viability sang selula gamit ang propidium iodide kag i-adjust ang densidad sang selula sa 1×106 tubtob 2×106 cells/ml. Antes sang flow cytometry, ang suspension ginsala paagi sa 50 μm nga cell strainer.
Flow cytometer. Ang pag-sort sang selula ginhimo sa 4°C gamit ang FACSAria III machine (BD Biosciences) kag FACSDiva software (BD Biosciences, version 8.0.1). Ang cell suspension gin-sort gamit ang 100 μm nozzle sa idalom sang pressure nga 20 psi sa kadasigon nga ~2800 events/sec. Sanglit ang tradisyonal nga mga talaksan sa pag-gate (kadakuon sang selula, bimodal nga diskriminasyon, kag mga kinaiya sang paglapta) indi makasiguro sang husto nga pag-isahanon sang PN gikan sa iban nga mga sahi sang selula, ang estratehiya sa pag-gate gintalana base sa direkta nga pagtandi sang intensidad sang YFP kag autofluorescence sa mitoYFP+ ​​kag ang kontrol nga mitoYFP − Mice. Ang YFP gina-excite paagi sa pag-irradiate sang sample gamit ang 488 nm laser line, kag ang signal gina-detect gamit ang 530/30 nm band pass filter. Sa mitoYFP+ ​​nga mga ilaga, ang relatibo nga kusog sang Rosa26-mitoYFP reporter gene ginagamit man sa pagkilala sang neuronal body kag axon fragments. Ang 7-AAD gina-excite sang 561 nm nga yellow laser kag na-detect sang 675/20 nm bandpass filter agud indi malakip ang mga patay nga selula. Agod mapain ang mga astrocyte sa amo man nga tion, ang cell suspension gin-stain sang ACSA-2-APC, dayon ang sample gin-irradiate sang 640 nm laser line, kag ang 660/20 nm bandpass filter gingamit sa pag-detect sang signal.
Ang nakolekta nga mga selula gin-pellet paagi sa centrifugation (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) kag gintago sa -80°C tubtob magamit. Ang mga ilaga nga Mfn2cKO kag ang ila mga litter pups ginaklasipikar sa pareho nga adlaw agud mapanubo ang pagkananuhaytuhay sang pamaagi. Ang presentasyon kag pag-analisar sang datos sang FACS ginhimo gamit ang FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Subong sang ginsambit sa ibabaw (59), ang real-time PCR ginagamit sa pag-isolate sang DNA gikan sa mga gin-sort nga mga neuron para sa masunod nga pag-isip sang mtDNA. Ang linearity kag threshold sensitivity una nga gintestingan paagi sa pagpadalagan sang qPCR sa nagkalainlain nga numero sang mga selula. Sa malip-ot nga pulong, kolektahon ang 300 PN sa isa ka lysis buffer nga ginabug-usan sang 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 kag proteinase K (200 ng/ml) kag i-incubate sa 55°C 120 minutos. Ang mga selula gin-incubate pa gid sa 95°C sa sulod sang 10 minutos agud masiguro ang bug-os nga pag-inactivate sang proteinase K. Gamit ang TaqMan probe (Thermo Fisher) nga espesipiko sa mt-Nd1, ang mtDNA gintakus paagi sa semi-quantitative PCR sa 7900HT Real-Time PCR system (Thermoherific Scientifics). Siyensya, numero sang katalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero sang katalogo AIVI3E8) kag 18S (Thermo Fisher Scientific, numero sang katalogo Hs99999901_s1) nga mga gene.
Paghanda sang sample sang proteome. Paagi sa pagpainit sang solusyon sa 95°C sa sulod sang 10 minutos kag pag-sonicate, sa lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide kag 100 mM tris- Lyse frozen neuron pellets sa HC pellets]. Sa Bioruptor (Diagenode) sa sulod sang 10 minutos (30 segundos nga pulso / 30 segundos nga pause period). Ang sample gin-dilute sang 1:10 sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ginsamo sa 300 ng trypsin gold (Promega), kag gin-incubate sa bilog nga gab-i sa 37°C agud matigayon ang kompleto nga pagtunaw. Sa ikaduha nga adlaw, ang sample gin-centrifuge sa 20,000 g sa sulod sang 20 minutos. Ang supernatant gin-dilute sang 0.1% formic acid, kag ang solusyon gin-desalt gamit ang self-made StageTips. Ang sample ginpamala sa isa ka instrumento sang SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) sa 45°C, kag dayon ang peptide ginsuspinde sa 0.1% formic acid. Ang tanan nga mga sample ginhanda sing dungan sang isa ka tawo. Agod ma-analisar ang mga sample sang astrocyte, 4 μg nga desalted peptides ang ginmarkahan sang tandem mass tag (TMT10plex, catalog number 90110, Thermo Fisher Scientific) nga may peptide to TMT reagent ratio nga 1:20. Para sa TMT labeling, 0.8 mg sang TMT reagent ang gin-resuspend sa 70 μl sang anhydrous ACN, kag ang uga nga peptide gin-reconstitute sa 9 μl sang 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), sa diin 7 μl sang TMT reagent sa ACN ang gindugang. Ang konsentrasyon 43.75%. Pagkatapos sang 60 minutos nga paglumlom, ang reaksyon ginpalong gamit ang 2 μl sang 5% hydroxylamine. Ang mga ginmarkahan nga mga peptide gintipon, ginpamala, gin-resuspend sa 200μl sang 0.1% formic acid (FA), gintunga sa duha, kag dayon gin-desalt gamit ang self-made StageTips. Gamit ang UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), ang isa sa duha ka katunga gin-fractionate sa 1mm x 150mm Acquity chromatographic column nga puno sang 130Å1.7μm C18 particles (Waters, catalog No: SKU 196366). Thermo Fisher Scientific). Ipain ang mga peptide sa flow rate nga 30μl/min, iseparar halin sa 1% tubtob 50% nga buffer B sa sulod sang 85 minutos nga may stepwise gradient nga 96 minutos, halin sa 50% tubtob 95% buffer B sa sulod sang 3 minutos, dayon 8 minutos para sa 95 % Buffer B; Ang buffer A amo ang 5% ACN kag 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), kag ang buffer B amo ang 80% ACN kag 10 mM ABC. Tipuna ang mga fraction kada 3 ka minutos kag tingbon ini sa duha ka grupo (1 + 17, 2 + 18, kag iban pa) kag pamalahon ini sa isa ka vacuum centrifuge.
LC-MS/MS nga pag-analisar. Para sa mass spectrometry, ang mga peptide (numero r119.aq) ginseparar sa isa ka 25 cm, 75 μm nga sulod nga diametro nga PicoFrit analytical column (bag-o nga objective lens, part number PF7508250) nga nasangkapan sang 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maisch, Maisch, UAS-YAS). 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany). Ang haligi ginpadayon sa 50°C. Ang mga buffer A kag B 0.1% formic acid sa tubig kag 0.1% formic acid sa 80% ACN, sa magkatuhay. Ang mga peptide ginseparar gikan sa 6% tubtob 31% buffer B sa sulod sang 65 minutos kag gikan sa 31% tubtob 50% buffer B sa sulod sang 5 minutos nga may gradient nga 200 nl/min. Ang mga eluted peptides gin-analisar sa isa ka Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ang pagsukol sang peptide precursor m/z ginahimo nga may resolusyon nga 120,000 sa range sang 350 tubtob 1500 m/z. Gamit ang 27% nga normalized collision energy, ang pinakamabaskog nga precursor nga may charge state nga 2 tubtob 6 ang ginapili para sa high energy C trap dissociation (HCD) cleavage. Ang oras sa siklo gitakda sa 1 s. Ang m/z nga balor sang peptide fragment gintakus sa ion trap gamit ang pinakagamay nga target sang AGC nga 5×104 kag ang pinakamataas nga oras sang pag-indyeksion nga 86 ms. Pagkatapos sang pagkabahinbahin, ang precursor ginbutang sa listahan sang dinamiko nga pagdula sa sulod sang 45 s. Ang mga TMT-labeled peptides ginseparar sa 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap column (Thermo Fisher Scientific, numero sang katalogo 164942), kag ang mga spectra sang paglalin gin-analisar sa Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nga nasangkapan sang high-field ammetric aveform iMS (IMS) ang kagamitan (Thermo Fisher Scientific) naga-operate sa duha ka boltahe sang kompensasyon nga −50 kag −70 V. Ang MS3 nga ginpili base sa precursor sang pag-synchronize ginagamit para sa TMT report ion signal measurement. Ang pagbulag sang peptide ginhimo sa EASY-nLC 1200, gamit ang 90% linear gradient elution, nga may buffer concentration nga 6% tubtob 31%; ang buffer A 0.1% FA, kag ang buffer B 0.1% FA kag 80% ACN. Ang analitikal nga kolum gina-operate sa 50°C. Gamita ang FreeStyle (bersyon 1.6, Thermo Fisher Scientific) sa pagtunga sang orihinal nga file suno sa FAIMS compensation voltage.
Pagkilala kag pag-isip sang protina. Gamit ang integrated Andromeda search engine, ang orihinal nga datos gin-analisar gamit ang MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Magluwas sa Cre recombinase kag YFP nga mga pagkasunod-sunod nga nakuha gikan sa Aequorea victoria, ang mga spectra sang peptide fragment ginpangita para sa canonical sequence kag isoform sequence sang mouse reference proteome (Proteome ID UP000000589, gin-download gikan sa UniProt sang Mayo 2017) . Ang methionine oxidation kag protein N-terminal acetylation ginbutang bilang mga variable nga mga pagbag-o; cysteine ​​ficarbamoyl methylation ginbutang bilang fixed modifications. Ang mga parametro sang pagtunaw ginbutang sa "espesipiko" kag "trypsin/P". Ang minimum nga numero sang mga peptide kag razor peptide nga ginagamit para sa pagkilala sang protina amo ang 1; ang minimum nga numero sang pinasahi nga mga peptide amo ang 0. Sa idalom sang mga kondisyon sang pagpares sang peptide map, ang rate sang pagkilala sang protina amo ang 0.01. Ang "Ikaduha nga Peptide" nga kapilian gina-enable. Gamita ang "match between runs" nga opsyon sa pagbalhin sang madinalag-on nga mga pagkilala sa tunga sang nagkalainlain nga orihinal nga mga file. Gamita ang LFQ minimum ratio count 1 para sa label-free quantification (LFQ) (60). Ang intensidad sang LFQ ginasala para sa indi magkubos sa duha ka balido nga mga balor sa indi magkubos sa isa ka grupo sang genotype sa tagsa ka punto sang tion, kag gina-extrapolate gikan sa isa ka normal nga distribusyon nga may kalaparon sang. 0.3 kag magsaylo paidalom 1.8. Gamita ang Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) kag R (https://r-project.org/) sa pag-analisar sang mga resulta sang LFQ. Ang two-way moderate t test gikan sa limma software package gingamit para sa differential expression analysis (61). Ang pag-analisar sang datos sa pag-usisa ginahimo gamit ang ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally kag pheatmap. Ang TMT-based proteomics data gin-analisar gamit ang MaxQuant version 1.6.10.43. Pangitaa ang hilaw nga datos sang proteomics gikan sa database sang human proteomics sang UniProt, nga gin-download sang Septyembre 2018. Ang pag-analisar nagalakip sang isotope purity correction factor nga ginhatag sang manufacturer. Gamita ang limma sa R ​​para sa pag-analisar sang ekspresyon sang kinalain. Ang orihinal nga datos, mga resulta sang pagpangita sa database, kag ang data analysis workflow kag mga resulta tanan ginatago sa ProteomeXchange alliance paagi sa PRIDE partner repository nga may data set identifier PXD019690.
Ang mga anotasyon sa pag-obra nagapauswag sang pag-analisar. Ang Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) nga gamit gingamit sa pagdeterminar sang manggad sang mga termino sang functional annotation sang data set sa 8 ka semana (Figure 1). Sa malip-ot nga pulong, ang quantitative protein list nga nakuha gikan sa LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) data analysis ginagamit sa masunod nga mga filter criteria: Ang Mus musculus ginapili bilang species kag background, kag ang kategorya nagapakita sang P value nga gin-adjust ni Benjamini para sa enrichment 0.05 ukon mas manubo ginakabig nga makahulugan. Para sa sini nga graph, ang lima ka pinakamataas nga sobra nga mga kategorya sa tagsa ka cluster base sa gin-adjust nga P value ginapakita. Gamit ang madamo nga t-test, gamit ang duha ka hugna nga linear boost program ni Benjamini, Krieger, kag Yekutieli (Q = 5%), ang time-course protein expression analysis ginahimo sa importante nga mga kandidato nga nakilala sa tagsa ka kategorya, kag ang tagsa ka laray gina-analisar sing separado. Indi kinahanglan nga mag-adoptar sang isa ka makanunayon nga SD.
Agod mapaanggid ang mga resulta sini nga pagtuon sa ginbalhag nga mga database kag makahimo sang Venn diagram sa Figure 1, gintingob namon ang quantitative protein list upod sa MitoCarta 2.0 annotations (24). Gamita ang online tool nga Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) sa paghimo sang diagram.
Para sa detalyado nga impormasyon sa mga pamaagi sa estadistika nga gingamit para sa pag-analisar sang proteomics, palihog tan-awa ang katumbas nga seksyon sang mga Materyales kag mga Pamaagi. Para sa tanan nga iban pa nga mga eksperimento, ang detalyado nga impormasyon makita sa katumbas nga leyenda. Luwas kon may iban nga ginsambit, ang tanan nga datos ginapabutyag subong mean ± SEM, kag ang tanan nga pag-analisar sang estadistika ginhimo gamit ang GraphPad Prism 8.1.2 software.
Para sa mga dugang nga materyales para sa sini nga artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Isa ini ka bukas nga artikulo nga ginapanagtag sa idalom sang mga termino sang Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, nga nagapahanugot sang paggamit, pagpanagtag kag pagkopya sa bisan ano nga medium, basta ang katapusan nga paggamit indi para sa komersyal nga ganansya kag ang premis amo nga ang orihinal nga obra husto. Reperensya.
Pahibalo: Ginapangabay lang namon sa imo nga ihatag ang imo email address agud mahibaluan sang tawo nga imo ginarekomendar sa pahina nga luyag mo nga makita nila ang email kag indi ini spam. Indi kami magkuha sang bisan ano nga mga email address.
Ini nga pamangkot ginagamit sa pagtilaw kon ikaw isa ka bisita kag pagpugong sang awtomatiko nga pagsumiter sang spam.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pag-analisar sang proteomics sang mga dysfunctional neurons nagpakita nga ang mga programa sa metabolismo gina-aktibo sa pagkontra sa neurodegeneration.
Ni E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Ang pag-analisar sang proteomics sang mga dysfunctional neurons nagpakita nga ang mga programa sa metabolismo gina-aktibo sa pagkontra sa neurodegeneration.
©2020 Asosasyon sang Amerika para sa Pag-uswag sang Siyensya. ang tanan nga mga kinamatarong gintigana. Ang AAAS isa ka partner sang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kag COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.