Present†Current address: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Ang reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) amo ang panguna nga photosynthetic component sang purple phototrophic bacteria. Ginpakilala namon ang duha ka cryo-electron microscopy nga mga istruktura sang RC-LH1 complex gikan sa Rhodopseudomonas palustris. Ang 2.65-Å nga istruktura sang resolusyon sang RC-LH114-W complex ginabug-usan sang 14 ka subunit LH1 loops nga nagapalibot sa RC, nga ginabalabagan sang protina W, samtang ang complex nga wala sing protina-W bug-os nga RC nga komposisyon nga ginapalibutan sang RC. Ginsira ang 16 subunit LH1 loop. Ang pagtandi sining mga istruktura nagahatag sang mga panan-awan sa dinamika sang quinone sa RC-LH1 complex, lakip ang wala pa mapat-od nga mga pagbag-o sa konpormasyon kon nagabugkos sang quinone sa RC QB site, subong man ang lokasyon sang mga auxiliary quinone binding sites, nga nagabulig sa Pagpasa sa ila sa RC. Ang pinasahi nga istruktura sang W nga protina nagapugong sang pagsira sang LH1 loop, sa amo nagahimo sang isa ka alagyan para sa pagpadasig sang pagbayluhanay sang quinone/quinolone.
Ang enerhiya nga ginahatag sang photosynthesis makasustenir sang halos tanan nga kabuhi sa duta, kag may daku ini nga potensyal para sa solar biotechnology. Samtang ginapasanyog ang pangkalibutanon nga photosynthesis, ang purpura nga phototrophic nga bakterya nagapakita man sang nagkalainlain nga mga paagi sang enerhiya kag mga ikasarang sa metabolismo. Mahimo nila malikawan ang photosynthesis kag magtubo subong heterotrophic nga bakterya sa kadulom, mahimo nga mag-ayo sang nitroheno kag carbon dioxide, makahimo sang hydrogen, kag makaguba sang mga aromatic compound (1-3). Agod makahatag sing enerhiya para sa sini nga mga proseso, ang kapawa dapat madasig kag episyente nga mangin kemikal nga enerhiya. Ini nga proseso nagasugod kon ang light-trapping antenna complex nagasuyop sang kasanag kag nagasaylo sang na-trap nga enerhiya sa sentro sang reaksyon (RC), sa amo nagasugod ang pagbulagay sang karga (4 – 7). Ang panguna nga yunit sang photosynthesis sa purple phototrophic bacteria ginabug-usan sang type 2 RC, nga ginapalibutan sang light-harvesting complex 1 (LH1), nga nagaporma sang RC-LH1 core complex. Ang LH1 ginaporma sang isa ka array sang kurbado nga αβ heterodimers, nga ang tagsa sini nagabugkos sang duha ka bacterial chlorophyll (BChl) a molecules kag isa ukon duha ka carotenoids (8-12). Ang pinakasimple nga LH1 antenna ginabug-usan sang 16 ukon 17 αβ heterodimers nga nagapalibot sa RC (9-13) sa isa ka sirado nga loop, apang sa iban nga mga core complex, ang mga transmembrane peptide nagabalabag sang pagpadayon sang palibot nga LH1 , Sa amo nagapasanyog sang quinol/quinone diffusion sa tunga sang RC kag cytochrome bc complex (1111, 13). Ang purpura nga phototrophic nga tanum nga Rhodopseudomonas (Rps.) isa ka modelo nga organismo nga makahangop sang enerhiya kag pagbalhin sang electron nga nagasuporta sa photosynthesis. Ang unang kristal nga istruktura sa Rps. Ang modelo sang palustris RC-LH1 complex amo ang RC, nga ginapalibutan sang 15 ka heterodimeric LH1 loops, nga ginabalabagan sang isa ka wala mahibaluan nga protina nga ginatawag "Protein W" (14). Ang protina-W ginkilala bilang RPA4402, nga isa ka wala makilala nga 10.5kDa nga protina nga may tatlo ka gintagna nga transmembrane helices (TMH) (16). Ginaduso namon nga i-rename ang rpa4402 gene nga naga-encode sang protina W sa pufW agud mangin nahisuno sa nomenklatura nga ginagamit para sa mga gene nga naga-encode sang RC-L, M (pufL, pufM) kag LH1α, β (pufA, pufB) nga mga subunit. Sing makawiwili, ang protina-W yara lamang sa mga 10% sang RC-LH1, nga nagapakita sang Rps. ang palustris nagapatubas sang duha ka magkatuhay nga RC-LH1 nga mga komplikado. Diri, ginareport namon ang high-resolution cryo-EM (cryo-EM) nga mga istruktura sang duha ka core complexes, ang isa may protina W kag 14 αβ heterodimers, ang isa pa nga wala sing protina W kag isa ka sirado nga 16 Heterodimer LH1 loop. Ang amon istruktura nagarepresentar sang isa ka tikang nga pagbag-o sa paghangop sang RC-LH1 complex sang Rps. palustris, bangod gin-analisar namon ang homogenous nga populasyon sang tagsa ka variant kag may bastante nga resolusyon sa maathag nga pag-assign sang tagsa ka peptide kag bound pigments kag may kaangtanan nga mga lipid kag quinones. Ang pagtandi sining mga istruktura nagapakita nga ang tatlo ka TMH nga mga protina-W nga wala pa makita sa bisan ano nga iban pa nga RC-LH1 nga komplikado tubtob karon nagahimo sang isa ka quinone channel sa pagpadasig sang pagbayluhanay sang quinone/quinolone. Ang pila ka mga gintipigan nga lipid kag quinone binding sites nakilala, kag ginpahayag namon ang isa ka bag-o nga pagbag-o sa konpormasyon pagkatapos sang kombinasyon sang quinone kag RC, nga mahimo nga nagakabagay para sa photosystem II (PSII) RC sang oxygenated phototrophic organisms. Ang amon mga natukiban nagahatag sang bag-o nga mga panan-awan sa mga kinetiko sang pagbugkos kag pagbayluhanay sang quinone/quinolone sa RC-LH1 core complex sang purple phototrophic bacteria.
Agod mapadali ang detalyado nga pagtuon sa duha ka mga komplikado nga makita sa Rps. palustris, ginabulag namon ang tagsa ka RC-LH1 paagi sa mga pamaagi sa biochemical. Ang protina W-deficient complex (sa ulihi ginatawag nga ΔpufW) gintinluan gikan sa strain nga kulang sa pufW gene (16), kag isa lamang ka RC-LH1 complex ang mahimo nga mapatubas. Ang protina nga W nga may unod nga komplikado ginahimo sang isa ka sahi. Ang protina W sini nga strain ginbag-o nga may 10x His tag sa iya C-terminus, agud nga ang protina W-nga may unod nga komplikado mahimo nga epektibo nga matingob sa kalabanan nga kulang nga protina W paagi sa pag-immobilize sang metal. Ang komplikado epektibo nga nahamulag (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Subong sang makita sa Figure 1, ang duha ka mga komplikado nagaunod sang tatlo ka sub-unit RC (RC-L, RC-M kag RC-H) nga ginapalibutan sang isa ka LH1 antenna. Ang 2.80-A nga istruktura sang komplikado nga kulang sa protina-W nagapakita sang 16 αβ heterodimers, nga nagaporma sang isa ka sirado nga LH1 loop nga bug-os nga nagapalibot sa RC, nga sa ulihi ginatawag nga RC-LH116 nga komplikado. Ang 2.65Å nga istruktura sang protina-W-nga nagaunod sang komplikado may 14-heterodimer LH1 nga gin-utod sang protina-W, nga sa ulihi ginatawag nga RC-LH114-W.
(A kag B) Representasyon sang ibabaw sang compound. (C kag D) Ang mga pigment nga nabugkos nga ginapabutyag sa mga baras. (E kag F) Ang mga komplikado nga naobserbahan gikan sa cytoplasmic surface may mga peptide kag LH1 subunits nga ginarepresentar sa mga cartoons, kag ginnumerohan clockwise gikan sa protein-W gap [nagakaangay sa Rba numbering. sphaeroides complex (13)]. Para sa LH1-α, ang kolor sang subunit sang protina amo ang dilaw; para sa LH1-β, ang kolor sang subunit sang protina asul; para sa protina-W, ang protina pula; para sa RC-H, ini cyan; para sa RC-L, ini Orange; para sa RC-M, magenta. Ang mga cofactor ginarepresentar sang mga baras, ang berde nagarepresentar sang BChl kag BPh a nga mga molekula, ang purpura nagarepresentar sang mga carotenoid, kag ang dilaw nagarepresentar sang mga molekula sang UQ10. (G kag H) Ginpadaku nga pagtan-aw sang protina-W nga kal-ang sa katumbas nga rehiyon sang RC-LH114-W nga komplikado (G) kag RC-LH116 nga komplikado (H). Ang mga cofactor ginapakita sa porma sang pagpuno sang espasyo, ang chelated quinone ginapakita sa asul. Ang protina-W nga kal-ang ginapadaku sang isa ka asul nga putol-putol nga linya sa (G), kag ang magagmay nga mga buho sa diin ang quinone/quinolol nagalapta sa LH116 nga singsing ginapadaku sang isa ka itom nga putol-putol nga linya sa (H).
Ang Figure 1 (A kag B) nagapakita sang RC nga ginapalibutan sang bukas ukon sirado nga mga array sang LH1αβ heterodimers, nga ang tagsa sini nagabugkos sang duha ka BChl kag isa ka carotenoid (Figure 1, C kag D). Ang mga nauna nga pagtuon nagpakita nga ang Rps amo ang LH1 complex. Sa biosynthetic pathway sang spirulina xanthin, ini nga mga espesyi nagaunod sang nagkalainlain nga populasyon sang carotenoids (17). Apang, ang spiropyrroxanthin amo ang nagapangibabaw nga carotenoid kag ang kadamulon sini makatagbaw. Gani, ginpili namon nga modelohon ang spiroxanthin sa tanan nga mga lugar nga nagabugkos sang LH1. Ang alpha kag beta polypeptides amo ang isa ka TMH nga may malip-ot nga mga rehiyon sa guwa sang membrane (Figure 1, A, B, E, kag F). Bisan pa nga ang densidad sang 17 ka mga residue sa C-terminus wala maobserbahan, ang alpha polypeptide gin-utod gikan sa Met1 pakadto sa Ala46 sa duha ka mga komplikado. Ang β polypeptide ginbuhinan gikan sa Gly4 pakadto sa Tyr52 sa RC-LH116, kag gikan sa Ser5 pakadto sa Tyr52 sa RC-LH114-W. Wala sing densidad sang 3 ukon 4 N-terminal ukon 13 C-terminal residues ang naobserbahan (Figure S1). Ang pag-analisar sang mass spectrometry sang mixed RC-LH1 complex nga ginhanda gikan sa wild-type strain nagpakita nga ang nadula nga rehiyon amo ang resulta sang heterologous cleavage sang sini nga mga peptide (Figure S1 kag S2). Ang N-terminal formylation sang α-Met1 naobserbahan man (f). Ang pag-analisar nagpakita nga ang α-peptide ginabug-usan sang mga residue fMet1 tubtob Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, kag ang β-peptide ginabug-usan sang mga residue Ser2 tubtob Ala53, nga nagahisanto sing maayo sa manubo nga temperatura nga EM density map.
Ang koordinasyon sang α-His29 kag β-His36 nagahimo sang BChls nga mag-atubangay; ang tagsa ka αβ heterodimer nagatipon upod sa iya mga kaingod sa pagporma sang isa ka bukas nga loop (RC-LH114-W) ukon isa ka sirado nga loop (RC-LH116) sa palibot sang RC Ang exciton coupled pigment array (Figure 1, C kag D). Kon ipaanggid sa 877 nm nga banda sang RC-LH114-W, ang 880 nm nga pagsuyop sang pula nga pagbalhin sang RC-LH116 amo ang 3 nm (Figure 2A). Apang, ang circular dichroism spectrum halos pareho (Figure 2B), nga nagapakita nga bisan pa may maathag nga kinatuhayan sa tunga sang bukas kag sirado nga mga loop, ang lokal nga palibot sang BChls pareho gid. Ang absorption redshift mahimo nga resulta sang pagnubo sang thermal motion kag pagdugang sang stability sa closed loop (18, 19), ang pagbag-o sa pigment coupling nga gintuga sang closed loop (20, 21), ukon ang kombinasyon sining duha ka epekto (11).
(A) Ultraviolet/visible/near-infrared absorption spectrum, ang mga putukputukan sini ginmarkahan sang ila katumbas nga mga pigment kag gin-normalize sa BPh peak sa 775 nm. (B) Circular dichroism spectrum nga gin-normalize sa BChl absorbance sa 805 nm. (C kag D) Napili nga ΔA spectra gikan sa time-resolved absorption spectra sang RC-LH114-W complex (C) kag RC-LH116 complex (D). Para sa mas maayo nga pagkumparar, ang tanan nga mga spectra gin-normalize sa ∆A sang −A sa 0.2 ps. (E) Ang kadasigon sang cytochrome c2 oxidation pagkatapos sang irradiation sa presensya sang nagkalainlain nga konsentrasyon sang UQ2 (tan-awa ang Figure S8 para sa hilaw nga datos). (F) Sa mga selula nga ginpatubo sa idalom sang manubo, tungatunga ukon mataas nga intensidad sang kasanag (10, 30 ukon 300μMm-2 s-1, sa pagsunod), ang protina W kag RC-L nga mga subunit sa gintinluan nga komplikado kag ang ginbulag nga ratio sang membrane. Hibalua ang lebel sang protina paagi sa SDS-polyacrylamide gel electrophoresis kag immunoassay (tan-awa ang Figure S9 para sa hilaw nga datos). Hibalua ang ratio nga may kaangtanan sa gintinluan nga RC-LH114-W complex. Ang stoichiometric ratio sang RC-L sa protein-W sang complex amo ang 1:1.
Ang mga BChls sa posisyon 1 sa deformed αβ14 loop sang RC-LH114-W (Figure 1, A, C, kag E) mas malapit sa RC primary donor (P) sang 6.8Å sangsa katumbas nga BChls sa RC-LH116 (Figure. 1, B, D, kag F, kag S3); bisan pa, ang transient absorption kinetics sang duha ka complex nagapakita nga para sa RC-LH114-W kag RC-LH116, ang excitation energy transfer time constants halin sa LH1 pakadto sa RC amo ang 40 ± 4 kag 44 ± 3 ps (Figure 2). , C kag D, Figure S4 kag Table S2). Wala man sing daku nga kinatuhayan sa elektroniko nga pagbalhin sa sulod sang RC (Figure S5 kag may kaangtanan nga suplemento nga teksto). Ginasuspetsahan namon nga ang suod nga pag-anggid sang oras sang pagbalhin sang enerhiya sa tunga sang LH1 kag RC-P bangod sang kaanggid nga distansya, anggulo kag potensyal nga enerhiya sang kalabanan nga BChl sa duha ka LH1 loops. Daw subong bala nga ang pag-usisa sang LH1 energy pattern agud malab-ot ang minimum nga distansya indi mas madasig sangsa direkta nga pagbalhin sang enerhiya gikan sa suboptimal nga mga lugar pakadto sa RC. Ang open-loop LH1 loop sa RC-LH114-W mahimo man mag-agi sa indi importante nga thermal motion sa idalom sang manubo nga temperatura nga mga kondisyon para sa structural analysis, kag may mas malawig nga αβ14 ring conformation sa temperatura sang kwarto gikan sa pigmentation distance sang βBChls sa posisyon sang RC 1.
Ang RC-LH116 complex nagaunod sang 32 BChls kag 16 carotenoids, kag ang kabug-usan nga kahimusan sini pareho sa nakuha gikan sa Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB070 strain (IDC) (297) kag berde nga lumot (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pagkatapos sang pag-align, gamay lang nga mga paglihis sa mga posisyon sang αβ heterodimers ang naobserbahan, ilabi na ang 1-5, 15, kag 16 (Figure S6). Ang presensya sang protina-W may daku nga epekto sa istruktura sang LH1. Ang tatlo ka TMH sini ginaangot sang malip-ot nga mga loop, nga ang N-terminal yara sa lumen nga bahin sang complex kag ang C-terminal sa cytoplasmic nga bahin (Mga Pigura 1A kag 3, A tubtob D). Ang protina-W sa kadam-an hydrophobic (Figure 3B), kag ang TMH2 kag TMH3 nagapakig-angot sa LH1αβ-14 sa pagporma sang transmembrane surface (Figure 3, B kag E tubtob G). Ang interface ginabug-usan sang mga residue sang Phe, Leu kag Val sa rehiyon sang transmembrane. Ini nga mga residue ginatumpok sang mga hydrophobic amino acid kag αβ-14 nga mga pigmento. Ang pila ka polar residues nagaamot man sa interaksiyon, lakip ang hydrogen bond sa tunga sang W-Thr68 kag β-Trp42 sa ibabaw sang komplikado nga lungag (Figure 3, F kag G). Sa ibabaw sang cytoplasm, ang Gln34 yara sa tupad sang keto nga grupo sang αβ-14 carotenoids. Dugang pa, ang n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) nga molekula nasolbar, kag ang iya hydrophobic tail nagsangkad sa interface sa tunga sang protein-W kag αβ-14, kag ang lipid tail mahimo nga nahamtang sa lawas. Natalupangdan man namon nga ang mga rehiyon sang resolusyon sang C-terminal sang protina W kag RCH malapit gid, apang indi sa sulod sang sakop sang pagporma sang partikular nga mga interaksiyon (Figure 1, A kag E). Apang, mahimo nga may mga interaksiyon sa wala masolbar nga C-terminal amino acids sining duha ka protina, nga mahimo maghatag sang mekanismo para sa pagrekrut sang protina-W sa tion sang pagtipon sang RC-LH114-W complex.
(A) Ang protina-W, nga nagaatubang sa interface upod sa LH1αβ14 sa porma sang cartoon, may yara sang rod-shaped side chain (pula), nga ginapakita sa isa ka bahin sang electrostatic potential diagram (transparent grey surface nga may contour level nga 0.13). (B) Protein-W nga ginarepresentar sang isa ka hydrophobic nga kolor nga nawong. Ang mga polar kag charged nga mga lugar ginapakita sa cyan, ang mga hydrophobic nga mga lugar ginapakita sa puti, kag ang mga lugar nga mabaskog nga hydrophobic ginapakita sa orange. (C kag D) Ang protina-W nga ginarepresentar sa cartoon, ang oryentasyon sini pareho sa (A) (C), kag gintuyok sang 180° (D). Suno sa posisyon sa pagkasunod-sunod, ang mga makilala nga mga residue nagagamit sang isa ka kolor sang balangaw, sa diin ang N-terminal asul kag ang C-terminal pula. (E) Protina-W sa pareho nga pagtan-aw subong sang sa (A), kag ang mga residue sa interface sang protina-W:LH1 ginarepresentar sang mga baras nga may mga marka nga nalakip. (F) Ang protina-W ginatuyok sing 90° kon ipaanggid sa (E) kag LH1αβ14 sa representasyon sang cartoon, kag kon ipaanggid sa mga residue sang interface sa representasyon sang bar. Ang mga nagabitay nga mga residue gikan sa beta polypeptide ginamarkahan. Ang cofactor ginapakita bilang isa ka bar nga nagasanto sa kolor sang Figure 1, ang nadunot nga β-DDM ginapakita sa abohon, kag ang oksiheno ginapakita sa pula. (G) Ang pagtan-aw sa (F) ginatuyok sing 180°, nga may mga prominente nga mga residue sang ginmarkahan nga alpha polypeptide.
Ang protina-W nagabulos sa isa ka αβ heterodimer (ang ika-15 sa Figure 1F), sa amo nagapugong sang pagsira sang loop kag nagakiling sang una nga tatlo ka αβ heterodimer. Naobserbahan nga ang pinakadaku nga anggulo sang pagkiling sang una nga αβ-1 heterodimer nga may kaangtanan sa normal nga pelikula amo ang 25° tubtob 29° (Figure 1, A kag E), nga naporma sang 2° tubtob 8° nga pagkiling sang αβ-1 sa RC A sharp contrast-LH116 (Figure 1, B kag F). Ang ikaduha kag ikatlo nga heterodimers nagakiling sa 12° tubtob 22° kag 5° tubtob 10°, sa magkatuhay. Bangod sang steric hindrance sang RC, ang pagkiling sang αβ-1 wala nagalakip sang ikaduha nga paris sang αβ (nga katumbas sa ika-16 nga αβ sa Figure 1F), gani nagaporma sang maathag nga kal-ang sa LH1 ring (Figure 1, A kag E) . Bangod sang kakulang sang duha ka αβ heterodimers, nga ginaupdan sang pagkadula sang apat ka BChl kag duha ka carotenoids, wala sing isa sa mga carotenoids ang nagabugkos sa twisted αβ-1 subunit, nga nagaresulta sa LH114-W ring nga nagaunod sang 13 ka carotenoids Vegetarian kag 28 BChls. Ang lokal nga mga pagbanta sang resolusyon sang duha ka mga komplikado sa αβ1 tubtob 7 nga mga rehiyon mas manubo sangsa nabilin nga bahin sang LH1 loop, nga mahimo nagapakita sang kinaugali nga plasticity sang LH1 subunit nga tupad sa RC QB site (Figure 4) .
Ang mga laragway sang RC-LH114-W (A kag B) kag RC-LH116 (C kag D) ginapakita gikan sa pareho nga top view/side view (A kag B) (A kag C) kag cavity surface sang Fig. 1. (B kag D). Ang mga kolor nga yawe gipakita sa tuo.
Ang isa pa lang ka kinaiya nga core complex nga may stoichiometric ratio nga 1:14 amo ang Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Apang, ang protina W kag PufX wala sing maathag nga homology, kag may daku nga epekto sa ila tagsa ka LH1 nga mga istruktura. Ang PufX isa ka TMH nga may N-terminal cytoplasmic domain nga nagapakig-angot sa cytoplasmic nga bahin sang RC-H subunit (13) sa posisyon nga katumbas sa Rps. palustris LH116αβ-16. Ang PufX nagahimo sang isa ka alagyan para sa pagbayluhanay sang quinone/quinolone sa tunga sang RC-LH1 kag sang cytochrome bcl complex kag yara sa tanan nga Rba. sphaeroides core complex (13). Bisan pa ang monomer-monomer interface yara sa Rba. Ang sphaeroides RC-LH1-PufX dimer nahamtang sa posisyon sang pagbugkos sang protina W sa RC-LH114-W, kag ang kal-ang nga gintuga sang PufX kag protina-W yara sa katumbas nga posisyon (Figure S7A). Ang kal-ang sa RC-LH114-W naga-align man sa hypothetical quinone channel (8) sang Pseudomonas rosea LH1, nga ginaporma sang mga peptide nga wala sing kaangtanan sa protina W ukon PufX (Figure S7B). Dugang pa, ang quinone channel sa Blc. Ang esmeralda nga berde nga LH1 nga naporma paagi sa pagdula sang isa ka γ subunit (7) nahamtang sa kaanggid nga posisyon (Figure S7C). Bisan pa nga ginapatunga sang nagkalainlain nga mga protina, ang hitsura sining mga quinone/quinolol channels sa isa ka kinaandan nga posisyon sa RC-LH1 complex daw isa ka halimbawa sang convergent evolution, nga nagapakita nga ang kal-ang nga gintuga sang protina W mahimo nga mag-akto bilang isa ka quinone channel.
Ang kal-ang sa LH114-W loop nagapahanugot sang pagporma sang isa ka padayon nga rehiyon sang membrane sa tunga sang internal nga espasyo sang RC-LH114-W complex kag sang bulk membrane (Figure 1G), sa baylo nga magkonektar sang duha ka domain paagi sa isa ka protina nga pore pareho sa mga protina. Ang RC-LH116 nga komplikado kaanggid sa isa ka sirado nga Tch. Daw dagom nga komplikado (22) (Figure 1H). Sanglit ang paglapnag sang quinone paagi sa membrane mas madasig sangsa paglapnag paagi sa makitid nga alagyan sang protina, ang bukas nga LH114-W loop mahimo magtugot sang mas madasig nga RC turnover sangsa sirado nga LH116 loop, kag ang paglapnag sang quinone sa RC mahimo nga mas limitado. Agod testingan kon bala ang protina W nagaapektar sa pagbag-o sang mga quinones paagi sa RC, naghimo kami sang isa ka cytochrome oxidation assay sa isa ka pat-od nga konsentrasyon sang ubiquinone 2 (UQ2) (isa ka analogue sang natural nga UQ10 nga may mas malip-ot nga isoprene tail) (Figure 2E). Bisan pa ang presensya sang chelated quinone nagaupang sa sibu nga pagdeterminar sang maathag nga Michaelis constant (RC-LH114-W kag RC-LH116 nagakabagay para sa 0.2±0.1μM kag 0.5±0.2μM, sa magkatuhay), ang pinakamataas nga rate sang RC-LH114-W ( 4.6±0.2012-1) amo ang s-1-1. 28±5% nga mas daku sangsa RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Una namon nga ginbulubanta nga ang protina-W yara sa mga 10% sang core complex (16); diri, ang mga rate sang pag-okupar sang mga selula nga nagatubo sa manubo nga kasanag, tungatunga nga kasanag, kag mataas nga kasanag amo ang 15±0.6%, 11±1% kag 0.9±0.5, sa magkatuhay nga % (Figure 2F). Ang quantitative nga pagtandi sang mass spectrometry nagpakita nga ang pagdugang sang histidine tag wala makapanubo sang relatibo nga kadamuon sang protina-W kon ipaanggid sa wild-type strains (P = 0.59), gani ining mga lebel indi isa ka artifact sang ginbag-o nga protina-W (Figure S10). Apang, ining manubo nga pag-okupar sang protina-W sa RC-LH1 complex mahimo nga magtugot sa pila ka RCs nga mag-flip sa madasig nga kadasigon, sa amo nagapahaganhagan sang mas mahinay nga pagbayluhanay sang quinone/quinolone sa RC-LH116 complex. Natalupangdan namon nga ang mataas nga light occupancy rate indi nagahisanto sa bag-o nga datos sang transcriptomics, nga nagapakita nga ang pufW gene expression nagadugang sa idalom sang mabaskog nga kasanag (Figure S11) (23). Ang kinatuhayan sa tunga sang pufW transcription kag protein-W nga paglakip sa RC-LH1 complex makalilibog kag mahimo nga nagapakita sang komplikado nga regulasyon sang protina.
Sa RC-LH114-W, 6 ka cardiolipin (CDL), 7 ka phosphatidylcholine (POPC), 1 ka phosphatidylglycerol (POPG) kag 29 ka β-DDM nga mga molekula ang gin-alokar kag ginmodelo sa sini 6 ka CDL, 24 ka POPC, 2 ka POPG kag 12 DMD. RC-LH116 (Figure 5, A kag B). Sa sining duha ka istruktura, ang CDL halos nahamtang sa cytoplasmic nga bahin sang komplikado, samtang ang POPC, POPG kag β-DDM kalabanan nahamtang sa luminal nga bahin. Duha ka lipid kag detergent nga mga molekula ang gin-isolate sa αβ-1 tubtob αβ-6 nga rehiyon sang RC-LH114-W complex (Figure 5A), kag lima ang gin-isolate sa katumbas nga rehiyon sang RC-LH116 (Figure 5B ). Mas madamo nga mga lipid ang nakit-an sa pihak nga bahin sang komplikado, labi na ang CDL, nga natipon sa tunga sang RC kag αβ-7 pakadto sa αβ-13 (Figure 5, A kag B). Ang iban pa nga mga lipid kag mga detergent nga nasolbar sa istruktura nahamtang sa guwa sang LH1 ring, kag ang mga kadena sang acyl nga nasolbar sing maayo nagalab-ot sa tunga sang mga subunit sang LH1, nga tentatibo nga gindesignar subong β-DDM sa RC-LH114-W, kag ginhatagan kahulugan subong β-DDM sa RC A nga sinagol sang β-DDM kag PO-LH116-LH16. Ang kaanggid nga mga posisyon sang chelating lipids kag detergents sa amon istruktura nagapakita nga sila mga physiologically relevant binding sites (Figure S12A). Ang mga posisyon sang katumbas nga mga molekula sa Tch may maayo man nga pagkamakanunayon. Malulo kag Trv. Ang strain 970 RC-LH1s (Figure S12, B to E) (9, 12) kag ang mga hydrogen-bonding residues sang lipid head group nagpakita sang maayo nga konserbasyon sa sequence alignment (Figure S13), nga nagapakita nga ang Conserved CDL nga nagabugkos sa RC (24), ini nga mga site mahimo nga mapreserbar sa RCH-LH1 complex.
(A kag B) Ang RC-LH114-W (A) kag RC-LH116 (B) nga mga peptide ginarepresentar sang mga cartoon, kag ang mga pigment ginarepresentar sang mga baras, gamit ang kolor nga iskema sa Figure 1. Ang mga lipid ginapakita sa pula, kag ang mga detergent ginapakita sa abohon. Ang UQ nga nagabugkos sa RC QA kag QB nga mga duog yellow, samtang ang isolated UQ asul. (C kag D) Pareho nga mga pagtan-aw sa (A) kag (B), nga may mga lipid nga wala ginlakip. (E pakadto sa G) Ginpadaku nga pagtan-aw sang Q1(E), Q2(F) kag Q3(G) gikan sa RC-LH116, nga may mga kadena sa kilid nga nagaimpluwensya sa isa kag isa. Ang mga hidroheno nga mga bugkos ginapakita subong itom nga mga linya nga may mga tuldok.
Sa RC-LH116, ang RC QA kag QB UQ, nga nagapakigbahin sa pagbalhin sang electron sa proseso sang pagbulag sang karga, nagakadunot sa ila mga binding sites. Apang, sa RC-LH114-W, ang QB quinone wala pa masolbar kag pagahambalan sing detalyado sa idalom. Magluwas sa QA kag QB quinones, duha ka chelated UQ molecules (nga nahamtang sa tunga sang RC kag LH1 rings) ang gina-alokar sa RC-LH114-W nga istruktura suno sa ila maayo nga nasolbar nga mga grupo sang ulo (nga nahamtang sa Q1 kag Q2, sa magkatuhay). espasyo). Pigura 5C). Duha ka isoprene units ang gin-assign sa Q1, kag ang density map nagasolbar sang kompleto nga 10 ka isoprene tails sang Q2. Sa istruktura sang RC-LH116, tatlo ka chelated UQ10 nga mga molekula (Q1 tubtob Q3, Figure 5D) ang nasolbar, kag ang tanan nga mga molekula may maathag nga densidad sa bug-os nga ikog (Figure 5, D tubtob G). Sa duha ka istruktura, ang mga posisyon sang mga grupo sang ulo sang quinone sang Q1 kag Q2 may maayo nga pagkamakanunayon (Figure S12F), kag nagapakig-angot lamang sila sa RC. Ang Q1 nahamtang sa entrada sang W gap sang RC-LH114-W (Figure 1G kag 5, C, D kag E), kag ang Q2 nahamtang malapit sa QB binding site (Figure 5, C, D) kag F). Ang napreserbar nga L-Trp143 kag L-Trp269 nga mga residue malapit gid sa Q1 kag Q2 kag nagahatag sang potensyal nga π-stacking nga mga interaksiyon (Figure 5, E kag F, kag Figure S12). Ang L-Gln88, 3.0 Å gikan sa distal oxygen sang Q1, nagahatag sang mabaskog nga hydrogen bond (Figure 5E); ini nga residue ginatipigan sa tanan nga RCs magluwas sa pinakamalayo nga kaangtanan (Figure S13). Ang L-Ser91 konserbatibo nga ginbuslan para sa Thr sa kalabanan nga iban pa nga RCs (Figure S13), amo ang 3.8 Angstroms gikan sa methyl oxygen sang Q1, kag mahimo nga maghatag sang mahuyang nga mga hydrogen bonds (Figure 5E). Ang Q3 daw wala sing partikular nga interaksiyon, apang nahamtang sa hydrophobic nga rehiyon sa tunga sang RC-M subunit kag LH1-α subunit 5 tubtob 6 (Figure 5, D kag G). Ang Q1, Q2 kag Q3 ukon ang malapit nga chelated quinones nasolbar man sa Tch. Malulo, Trv. Strain 970 kag Blc. Ang iris nga istruktura (9, 10, 12) nagatudlo sa isa ka napreserbar nga auxiliary quinone binding site sa RC-LH1 complex (Figure S12G). Ang lima ka nadunot nga UQ sa RC-LH116 nagahisanto sing maayo sa 5.8±0.7 sang tagsa ka komplikado nga napat-od sang mataas nga performance liquid chromatography (HPLC), samtang ang tatlo ka nadunot nga UQ sa RC-LH114-W mas manubo sangsa Ang gintakus nga balor sang 6.2±0.3 (Fig. S14) nagapakita nga wala sing mga molekula nga nasolbar ang UQ. straktura.
Ang pseudo-symmetric L kag M polypeptides ang tagsa nagaunod sang lima ka TMHs kag nagaporma sang isa ka heterodimer nga nagatingob sang isa ka BChl dimer, duha ka BChl monomers, duha ka bacteriophage (BPh) monomers, kag isa ka non- Heme iron kag isa ukon duha ka UQ10 nga mga molekula. Paagi sa presensya sang mga hydrogen bonds sa terminal ketone group kag ang nahibal-an nga pagtipon sini sa Rps, ang mga carotenoids ginalakip sa M-subunit, nga ginatawag nga cis-3,4-dehydroorhodopin. Mga espesyi (25). Ang outer membrane domain sang RC-H gina-angkla sa membrane sang isa ka TMH. Ang kabug-usan nga istruktura sang RC kaanggid sa tatlo ka subunit RC sang mga may kaangtanan nga mga espesyi (subong sang Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Ang mga macrocycles sang BChl kag BPh, ang carotenoid backbone kag non-heme iron naga-overlap sa sulod sang resolution range sang sini nga mga istruktura, subong man ang UQ10 head group sa QA site kag ang QB quinone sa RC-LH116 (Figure S15).
Ang pagkabaton sang duha ka istruktura sang RC nga may lainlain nga mga rate sang pag-okupar sang QB site nagahatag sang bag-o nga oportunidad sa pag-usisa sang nagakaigo nga mga pagbag-o sa konpormasyon nga nagaupod sa pagbugkos sang QB quinone. Sa RC-LH116 complex, ang QB quinone nahamtang sa bug-os nga nabugkos nga "proximal" nga posisyon (26), apang ang pagbulag sang RC-LH114-W wala sing QB quinone. Wala sing QB quinone sa RC-LH114-W, nga makatilingala bangod ang complex aktibo, labi pa sangsa RC-LH116 complex nga may structurally resolved QB quinone. Bisan pa ang duha ka LH1 nga mga singsing naga-chelate sang mga anom ka quinones, lima ang nasolbar sa istruktura sa sirado nga RC-LH116 nga singsing, samtang tatlo lamang ang limitado sa istruktura sa bukas nga RC-LH114-W nga singsing. Ining nadugangan nga structural disorder mahimo nga nagapakita sang mas madasig nga pag-ilis sang RC-LH114-W QB sites, mas madasig nga quinone kinetics sa complex, kag nadugangan nga posibilidad nga magtabok sa LH1 loop. Ginapanugyan namon nga ang kakulang sang UQ sa RC QB site sang RC-LH114-W mahimo nga resulta sang mas komplikado kag mas aktibo nga komplikado, kag ang QB site sang RC-LH114-W gilayon nga nagyelo sa UQ turnover Ang partikular nga yugto (ang entrada sa QB site ginsirado) nagapakita sang konpormasyon sini nga aktibo.
Kon wala ang QB, ang kaupod nga pagtuyok sang L-Phe217 sa isa ka posisyon nga indi nagakaigo sa UQ10 nga nagabugkos, bangod magatuga ini sang isa ka spatial collision sa una nga isoprene unit sang ikog (Figure 6A). Dugang pa, ang maathag nga panguna nga mga pagbag-o sa konpormasyon maathag, ilabi na ang helix de (malip-ot nga helix sa loop sa tunga sang TMH D kag E) sa diin ang L-Phe217 ginasaylo sa QB binding pocket kag ang pagtuyok sang L-Tyr223 (Figure 6A ) Sa pagguba sang hydrogen bond upod sa M-Ap4 framework kag siraduhan ang entrance sang binding sang QB site (Figure 6B). Ang Helix de pivot sa iya base, ang Cα sang L-Ser209 ginasaylo sang 0.33Å, samtang ang L-Val221Cα ginasaylo sang 3.52Å. Wala sing makita nga mga pagbag-o sa TMH D kag E, nga sarang ma-superimpose sa duha ka istruktura (Figure 6A). Sa amon nahibaluan, amo ini ang una nga estraktura sa natural nga RC nga nagasira sang QB site. Ang pagtandi sa kompleto (QB-bound) nga istruktura nagapakita nga antes mabuhinan ang quinone, kinahanglan ang pagbag-o sang konpormasyon agud makasulod ini sa quinone. Ang L-Phe217 nagatuyok sa pagporma sang π-stacking interaction sa quinone head group, kag ang helix nagasaylo pa gwa, nga nagatugot sa skeleton sang L-Gly222 kag sa side chain sang L-Tyr223 sa pagporma sang hydrogen bond network nga may stable hydrogen bond structure (Figure 6, A kag C).
(A) Nagatungtong nga cartoon sang hologram (L chain, orange/M chain, magenta) kag apo (gray) nga istruktura, sa diin ang mga yabi nga mga residue ginapakita sa porma sang isa ka representasyon nga daw baras. Ang UQ10 ginarepresentar sang isa ka dilaw nga bar. Ang tuldok nga linya nagapakita sang mga higot sang hidroheno nga naporma sa bug-os nga estraktura. (B kag C) Ang representasyon sa ibabaw sang apolipoprotein kag ang bug-os nga istruktura sang singsing, nga nagapakita sang side chain oxygen sang L-Phe217 sa asul kag L-Tyr223 sa pula, sa magkatuhay. Ang L subunit orange; ang M kag H nga mga subunit wala sing duag. (D kag E) Apolipoprotein (D) kag bug-os (E) RC QB sites [color by (A) respectively] kag Thermophilus thermophilus PSII (berde, asul nga may plastic quinone; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Sa wala ginapaabot, bisan pa nga ang pila ka mga istruktura sang QB-deficient RCs nga wala sing LH1 magamit, ang mga pagbag-o sa conformational nga naobserbahan sa sini nga pagtuon wala pa nareport sang una. Lakip sa sini ang istruktura sang pag-ubos sang QB gikan sa Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) kag Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tanan ini halos pareho sa ila kabug-usan nga istruktura sang QB. Ang maid-id nga pag-usisa sa 3PRC nagpakita nga ang LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) nga mga molekula sang detergent nagabugkos sa entrada sang posisyon sang QB, nga mahimo makapugong sang pag-areglo liwat sa isa ka sirado nga konpormasyon. Bisan pa ang LDAO wala nagakadunot sa pareho nga posisyon sa 1EYS ukon 1OGV, ining mga RC ginahanda gamit ang pareho nga detergent kag busa mahimo nga makahimo sang pareho nga epekto. Ang kristal nga istruktura sa Rba. Ang Sphaeroides RC nga gin-co-crystallize upod sa cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) daw may yara man sang sirado nga QB site. Apang, sa sini nga kaso, ang N-terminal nga rehiyon sang RC-M polypeptide (nagapakig-angot sa QB binding site paagi sa H bond sang Tyr residue sa Q helix) naga-adoptar sang isa ka indi kinaugali nga konpormasyon, kag ang pagbag-o sang konpormasyon sang QB wala pa ginausisa (30 ). Ang makapasalig amo nga wala naton nakita ini nga sahi sang pagbag-o sang M polypeptide sa RC-LH114-W nga istruktura, nga halos pareho sa N-terminal nga rehiyon sang RC-LH116 RC. Dapat man talupangdon nga pagkatapos sang pagdula sang detergent-based LH1 antenna, ang mga apolipoprotein RCs sa PDB nasolbar, nga nagdula sang mga internal quinone pools kag lipids sa gap sa tunga sang RC kag sang nasulod nga nawong sang palibot nga LH1 ring (31, 32). Ang RC nagapabilin nga nagapanghikot bangod ginahuptan sini ang tanan nga mga cofactor, magluwas sa decomposable QB quinone, nga indi tanto ka malig-on kag masami nga madula sa tion sang proseso sang paghanda (33). Dugang pa, nahibal-an nga ang pagkuha sang LH1 kag natural nga cyclic lipids gikan sa RC mahimo nga may epekto sa mga function, pareho sang ginpalip-ot nga kabuhi sang charge-separated P+QB-state (31, 34, 35). Gani, ginabanabana namon nga ang pagluntad sang lokal nga LH1 ring nga nagapalibot sa RC mahimo nga magmentinar sang "sirado" nga QB site, sa amo ginapreserbar ang lokal nga palibot malapit sa QB.
Bisan pa ang apolipoprotein (nga wala sang QB quinone) kag ang kompleto nga istruktura nagarepresentar lamang sang duha ka snapshot sang turnover sang QB site, sa baylo nga isa ka serye sang mga hitabo, may mga indikasyon nga ang pagbugkos mahimo nga ma-gate agud malikawan ang pag-rebinding sang hydroquinone Sa pagpugong sang substrate inhibition. Ang interaksiyon sang quinolol kag quinone malapit sa QB site sang apolipoprotein mahimo nga magkatuhay, nga nagadul-ong sa pagsikway sini sang RC. Madugay na nga ginaduso nga ang mga pagbag-o sa konpormasyon may papel sa pagbugkos kag pagnubo sang mga quinones. Ang ikasarang sang mga frozen RCs sa pagpanubo sang mga quinones pagkatapos sang madulom nga pagpasibu nahalitan (36); Ginapakita sang X-ray crystallography nga ini nga kahalitan bangod sang QB quinones nga na-trap sa isa ka “distal” nga konpormasyon mga 4.5 Å gikan sa aktibo nga proximal nga posisyon (26) , 37). Ginapanugyan namon nga ining distal binding conformation isa ka snapshot sang intermediate state sa tunga sang apolipoprotein kag sang bug-os nga istruktura sang singsing, nga nagasunod sa una nga interaksiyon sa quinone kag ang pagbukas sang QB site.
Ang type II RC nga makita sa PSII complex sang pila ka phototrophic bacteria kag cyanobacteria, algae kag mga tanum may yara sang structural kag functional nga pagtipig (38). Ang pag-align sang istruktura nga ginapakita sa Figure 6 (D kag E) nagapadaku sang pagkaanggid sa tunga sang PSII RCs kag ang QB site sang bacterial RC complex. Ini nga pagtandi madugay na nga nangin modelo sa pagtuon sang suod nga may kaangtanan nga mga sistema sang pagbugkos kag pagnubo sang quinone. Ang mga nauna nga publikasyon nagpanugda nga ang mga pagbag-o sa konpormasyon ginaupdan sang pagnubo sang PSII sang mga quinones (39, 40). Gani, kon binagbinagon ang ebolusyonaryo nga pagtipig sang RC, ining wala pa maobserbahan nga mekanismo sang pagbugkos mahimo man nga magamit sa QB site sang PSII RC sa mga tanum nga phototrophic nga may oxygen.
Rps ΔpufW (unlabeled pufW deletion) kag PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W nga ginpabutyag gikan sa natural nga pufW locus) nga mga strain. ang palustris CGA009 ginlaragway sa amon nauna nga buluhaton (16). Ining mga strain kag ang isogenic wild-type nga ginikanan nakuha gikan sa freezer paagi sa pag-streak sang gamay nga numero sang mga selula sa PYE (tagsa ka 5 g litro -1) (ginatago sa LB sa -80 °C, nga nagaunod sang 50% ( w/v) glycerol) nga protina, yeast extract kag succinate) agar [1.5%) (w/v) plate. Ang plato gin-incubate sa bug-os nga gab-i sa kadulom sa temperatura sang kwarto sa idalom sang anaerobic nga mga kondisyon, kag dayon gin-iwag sang puti nga kapawa (~50 μmolm-2 s-1) nga ginhatag sang OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) sa sulod sang 3 tubtob 5 ka adlaw tubtob nga ang isa ka kolonya nagguwa. Ang isa ka kolonya gingamit sa pag-inoculate sang 10 ml sang M22+ medium (41) nga gindugangan sang 0.1% (w/v) casamino acids (sa ulihi ginatawag nga M22). Ang kultura ginpatubo sa idalom sang manubo nga kondisyon sang oksiheno sa kadulom sa 34°C nga may pag-uyog sa 180 rpm sa sulod sang 48 ka oras, kag dayon 70 ml sang kultura ang ginbakunahan sa idalom sang amo man nga mga kondisyon sa sulod sang 24 ka oras. Ang semi-aerobic culture nga may volume nga 1 ml ginagamit sa pag-inoculate sang 30 ml sang M22 medium sa 30 ml nga universal screw-top transparent glass bottle kag gina-irradiate sang agitation (~50μmolm-2 s-1) sa sulod sang 48 ka oras paagi sa sterile magnetic force Stirring rod. Dayon 30 ml sang kultura ang gin-inoculate sang mga 1 litro sang kultura sa idalom sang pareho nga mga kondisyon, nga dayon gingamit sa pag-inoculate sang mga 9 ka litro sang kultura nga gin-iwag sa ~200 μmolm-2 s-1 sa sulod sang 72 ka oras. Ang mga selula gin-ani paagi sa centrifugation sa 7132 RCF sa sulod sang 30 minutos, gin-resuspend sa ~10 ml sang 20 mM tris-HCl (pH 8.0), kag gintago sa -20°C tubtob kinahanglanon.
Pagkatapos sang pagtunaw, idugang ang pila ka kristal sang deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) kag duha ka Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) sa mga resuspended nga mga selula. Sa isa ka 20,000 psi French pressure cell (Aminco, USA), ang mga selula gintublag sing 8 tubtob 12 ka beses. Pagkatapos nga makuha ang wala mabungkag nga mga selula kag indi matunaw nga mga tinumpag paagi sa centrifugation sa 18,500 RCF sa sulod sang 15 minutos sa 4°C, ang membrane gin-precipitate gikan sa pigmented lysate paagi sa centrifugation sa 113,000 RCF sa sulod sang 2 ka oras sa 43,000°C. Ihaboy ang matunaw nga bahin kag i-resuspend ang de-kolor nga membrane sa 100 tubtob 200 ml sang 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kag i-homogenize tubtob nga wala na sing makita nga mga aggregates. Ang suspended membrane gin-incubate sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) nga may 2% (w/v) β-DDM sa sulod sang 1 ka oras sa kadulom sa 4°C nga may malulo nga pag-uyog. Dayon i-centrifuge sa 70°C agud matunaw ang 150,000 RCF sa 4°C sa sulod sang 1 ka oras agud makuha ang nabilin nga indi matunaw.
Ang solubilizing membrane gikan sa ΔpufW strain gin-apply sa 50 ml DEAE Sepharose ion exchange column nga may tatlo ka column volumes (CV) sang binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga nagaunod sang 0.03% (w / v) β-DDM]. Hugasi ang haligi gamit ang duha ka CV binding buffer, kag dayon hugasi ang haligi gamit ang duha ka binding buffer nga may 50 mM NaCl. Ang RC-LH116 complex gin-elute gamit ang linear gradient sang 150 tubtob 300 mM NaCl (sa binding buffer) sa 1.75 CV, kag ang nabilin nga binding complex gin-elute gamit ang binding buffer nga may 300 mM NaCl sa 0.5 CV. Tipuna ang absorption spectrum sa tunga sang 250 kag 1000 nm, huptan ang fraction nga may absorbance ratio (A880/A280) nga mas daku sangsa 1 sa 880 tubtob 280 nm, lasaw ini sing makaduha sa binding buffer, kag gamita liwat ang amo man nga pamaagi sa DEAE column Sa pagtinlo. I-dilute ang mga fraction nga may A880/A280 ratios nga mas mataas sangsa 1.7 kag A880/A805 ratios nga mas mataas sangsa 3.0, himua ang ikatlo nga hugna sang pagbayluhanay sang ion, kag huptan ang mga fraction nga may A880/A280 ratios nga mas mataas sangsa 2.2 kag A880/A805 ratios nga mas mataas sangsa 5.0.0. Ang partially purified complex ginkonsentrar sa ~2 ml sa isa ka Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), kag ginkarga sa isa ka Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) nga nagaunod sang 200 mM NaCl buffer, kag dayon gin-elution sa amo man nga buffer. CV. Tipuna ang mga spectra sang pagsuyop sang bahin sang pagdula sang kadakuon, kag ikonsentrar ang mga spectra sang pagsuyop nga may A880/A280 nga mga ratio sa ibabaw sang 2.4 kag A880/A805 nga mga ratio sa ibabaw sang 5.8 tubtob 100 A880, kag gamiton ini gilayon para sa paghanda sang cryo-TEM grid ukon pagtipig Hupti sa -80°C tubtob kinahanglanon.
Ang solubilizing membrane gikan sa PufW-His strain gin-apply sa 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga nagaunod sang 200 mM NaCl kag 0.03% (w/w)) sa IMAC buffer ( GE Healthcare). v) β-DDM]. Ang haligi ginhugasan sang lima ka CVs sang IMAC buffer, kag dayon sang lima ka CVs sang IMAC buffer nga may 10 mM histidine. Ang core complex gin-elute gikan sa haligi nga may lima ka IMAC buffers nga may 100 mM histidine. Ang fraction nga nagaunod sang RC-LH114-W complex ginakonsentrar sa ~10 ml sa isa ka gin-uyog nga tangke nga nasangkapan sang Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK), ginlasaw sing 20 ka beses gamit ang binding buffer, kag dayon gindugang sa 25 ml Sa DEAE Sepharose column, apat ka CV buffer ang gingamit sa una nga buffer. Hugasi ang haligi gamit ang apat ka CV binding buffers, dayon i-elute ang complex sa walo ka CVs sa linear gradient sang 0 tubtob 100 mM NaCl (sa binding buffer), kag ang nabilin nga apat ka CVs nga nagaunod sang 100 mM binding buffer Ang nabilin nga mga complexes nga gin-elute sa sodium chloride nga gintingob sa A888/2000 ratio kag mas mataas sangsa ratio sangsa 2004. Ang A880/A805 nga ratio nga mas mataas sangsa 4.6 nga mga bahin ginkonsentrar sa ~2 ml sa isa ka Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter, kag ginpuno sang 1.5 CV IMAC sa abanse Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 size exclusion column, kag dayon gin-elute sa amo man nga buffer sa ibabaw sang 1.5V CV. Tipuna ang mga spectra sang pagsuyop sang mga bahin nga wala nagalakip sang kadakuon kag ikonsentrar ang mga spectra sang pagsuyop nga may A880/A280 nga mga ratio sa ibabaw sang 2.1 kag A880/A805 nga mga ratio sa ibabaw sang 4.6 tubtob 100 A880, nga gilayon nga ginagamit para sa paghanda sang frozen TEM grid ukon ginatago sa -80°C tubtob kinahanglanon.
Ang Leica EM GP immersion freezer gingamit sa paghanda sang manubo nga temperatura nga TEM grids. Ang complex ginlasaw sa IMAC buffer sa A880 sang 50, kag dayon ang 5μl ginkarga sa isa ka bag-o nga glow-discharged QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK). I-incubate ang grid sa 20°C kag 60% nga relatibo nga kaumog sa sulod sang 30 s, dayon pamala ini sa sulod sang 3 s, kag dayon palong ini sa likido nga ethane sa -176°C.
Ang datos sang RC-LH114-W complex ginrekord sa eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) gamit ang Titan Krios microscope, nga nagatrabaho sa isa ka nagapadasig nga boltahe nga 300kV, nga may nominal nga pagpadaku nga 130,000× kag isa ka enerhiya sang Choose gap nga 200kV. Ang Gatan 968 GIF Quantum nga may K2 peak detector gingamit sa pagrekord sang mga laragway sa counting mode sa pagtipon sang datos. Ang gin-calibrate nga kadakuon sang pixel amo ang 1.048Å, kag ang dose rate amo ang 3.83 e-Å-2s-1. Gintipon ang pelikula sa sulod sang 11 ka segundo kag gintunga ini sa 40 ka bahin. Gamita ang carbon-coated nga lugar sa pag-refocus sang mikroskopyo, kag dayon magtipon sang tatlo ka pelikula kada buho. Sa kabilugan, 3130 ka mga pelikula ang nakolekta, nga may mga balor sang defocus sa tunga sang -1 kag -3μm.
Ang datos para sa RC-LH116 complex gintipon gamit ang amo man nga mikroskopyo sa Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). Ang datos gintipon sa counting mode nga may magnification nga 130 k, kag ang kadakuon sang pixel gin-calibrate sa 1.065 Å nga may dosis nga 4.6 e-Å-2s-1. Ang pelikula ginrekord sa sulod sang 12 segundos kag gintunga sa 48 ka bahin. Sa kabilugan, 3359 ka mga pelikula ang nakolekta, nga may mga bili sang defocus sa tunga sang -1 kag -3μm.
Ang tanan nga pagproseso sang datos ginahimo sa Relion 3.0 pipeline (42). Gamita ang Motioncorr 2 (43) sa pagtadlong sang paghulag sang sinag paagi sa dose weighting, kag dayon gamita ang CTFFIND 4.1 (44) sa pagdeterminar sang CTF (contrast transfer function) nga parameter. Ang kinaandan nga mga photomicrograph pagkatapos sining una nga mga hugna sang pagproseso ginapakita sa Figure 2. S16. Ang awtomatiko nga template sang pagpili ginahimo paagi sa mano-mano nga pagpili sang mga 250 ka piksel sang 1000 ka mga partikulo sa isa ka 250-piksel nga frame kag wala sing reperensya nga duha ka dimensional (2D) nga klasipikasyon, sa amo ginasikway yadtong mga klasipikasyon nga nagasabat sa kontaminasyon sang sample ukon wala sing makita nga mga kinaiya. Dayon, ang awtomatiko nga pagpili ginhimo sa tanan nga mga microphotograph, kag ang RC-LH114-W 849,359 ka mga partikulo, kag ang RC-LH116 nga komplikado 476,547 ka mga partikulo. Ang tanan nga napili nga mga partikulo nag-agi sa duha ka hugna sang non-reference 2D nga klasipikasyon, kag pagkatapos sang tagsa ka pagdalagan, ang mga partikulo nga nagasugata sa carbon area, kontaminasyon sang sample, wala sing maathag nga mga bahin ukon mabaskog nga naga-overlap nga mga partikulo ang ginsikway, nga nagresulta sa 772,033 (90.9%) kag 359,678 (75.5%) nga mga partikulo ang gingamit para sa 3D nga klasipikasyon sang 3D nga klasipikasyon. RC-LH114-W kag RC-LH116 sa magkatuhay. Ang una nga 3D nga modelo sang reperensya ginhimo gamit ang stochastic gradient descent method. Gamit ang una nga modelo bilang reperensya, ang mga napili nga mga partikulo ginklasipikar sa apat ka mga kategorya sa 3D. Gamit ang modelo sa sini nga kategoriya bilang reperensya, himua ang 3D nga pagpino sa mga partikulo sa pinakadaku nga kategoriya, dayon gamita ang una nga 15Å low-pass filter sa pagtabon sang solvent area, magdugang sang 6 ka pixel sang mahumok nga mga ukbong, kag i-post-process ang mga pixel sa pagtadlong sang Gatan K2 peak Modulation transfer function sang top detector. Para sa RC-LH114-W dataset, ini nga una nga modelo ginbag-o paagi sa pagkuha sang mabaskog nga densidad sa mga ukbong sang maskara (nga wala naangot sa core complex density sa UCSF Chimera). Ang resulta nga mga modelo (ang mga resolusyon sang RC-LH114-W kag RC-LH116 amo ang 3.91 kag 4.16 Å, sa magkatuhay) ginagamit bilang reperensya para sa ikaduha nga hugna sang 3D nga klasipikasyon. Ang mga partikulo nga gingamit gin-grupo sa una nga 3D nga klase kag wala nagaunod sang mabaskog nga kaangtanan sa kasilingan. Overlap ukon kakulang sang maathag nga mga bahin sang istruktura. Pagkatapos sang ikaduha nga hugna sang 3D nga klasipikasyon, ang kategorya nga may pinakamataas nga resolusyon ang ginpili [Para sa RC-LH114-W, ang isa ka kategorya amo ang 377,703 ka mga partikulo (44.5%), para sa RC-LH116, may duha ka mga kategorya, nga nagabug-os sang 260,752 ka mga partikulo (54.77 h% Wh), kon ang pareho lamang nga mga partikulo pagkatapos nila ginalinya, kon pareho lang sila pagkatapos. una nga pagtuyok nga may gamay nga kinalain]. Ang mga napili nga mga partikulo ginakuha liwat sa isa ka 400-pixel nga kahon kag ginapino paagi sa 3D nga pagpino. Ang solvent mask ginahimo gamit ang una nga 15Å low-pass filter, 3 pixel map expansion kag 3 pixel soft mask. Gamit ang kada partikulo nga pagpino sang CTF, kada partikulo nga pagtadlong sang paghulag kag ang ikaduha nga hugna sang kada partikulo nga pagpino sang CTF, ang 3D nga pagpino, solvent masking kag post-processing ginahimo pagkatapos sang tagsa ka tikang agud labi pa nga mapino ang resulta nga texture. Gamit ang FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off value nga 0.143, ang mga resolusyon sang katapusan nga mga modelo sang RC-LH114-W kag RC-LH116 amo ang 2.65 kag 2.80Å, sa magkatuhay. Ang FSC curve sang katapusan nga modelo makita sa Figure 2. S17.
Ang tanan nga mga pagkasunod-sunod sang protina gina-download gikan sa UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Ang SWISS-MODEL (45) gingamit sa pagtukod sang isa ka modelo sang homology sang RC, nga nagaunod sang mga pagkasunod-sunod sang protina sang RC-L, RC-M kag RC-H kag ang istruktura sang kristal sang Rba. ang sphaeroides RC gingamit bilang isa ka sulundan (PDB ID: 5LSE) (46). Gamita ang "fit map" nga gamit sa UCSF Chimera sa pag-igo sang nahimo nga modelo sa mapa (47), pauswagon ang istruktura sang protina, kag cofactor [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), isa ukon duha ka sahi sang UQ10 (U10), isa ka non-heme iron (Fe) kag isa ka hexa-hydrocary,44 (QAK)] gamita ang Coot (48) sa pagdugang. Sanglit ang QAK indi matigayon sa monomer library, gin-parameterize ini gamit ang eLBOW tool sa PHENIX (49).
Masunod, ang LH1 subunit gintukod. Sa umpisa, ang awtomatiko nga gamit sa pagtukod sa PHENIX (49) gingamit sa awtomatiko nga pagtukod sang bahin sang LH1 nga pagkasunod-sunod gamit ang mapa kag ang LH1-α kag LH1-β nga mga pagkasunod-sunod sang protina bilang input. Pilia ang pinakakumpleto nga LH1 subunit, kuhaa ini kag ikarga ini sa Coot, mano-mano nga idugang ang nadula nga pagkasunod-sunod sa sini, kag mano-mano nga i-refine ang bug-os nga istruktura antes magdugang sang duha ka BCls a (BCL) kag isa ka spirilloxanthin (CRT) [suno sa nagakaigo nga Rps Ang densidad sang LH1 complex kag ang nahibal-an nga carotenoid nga kaundan. Mga espesyi (17)]. Kopyaha ang kompleto nga LH1 subunit, kag gamita ang UCSF Chimera "Docking Map Tool" sa pag-dock sa kaiping nga non-model area sang LH1 density, kag dayon i-refine ini sa Coot; sulita ang proseso tubtob nga ang tanan nga LH1 subunits namodelo. Para sa RC-LH114-W nga istruktura, paagi sa pagkuha sang wala gin-alokar nga densidad sa Coot, ang protina ginatunga gikan sa nabilin nga mga non-protein components sa USCF Chimera map kag ang Autobuild tool ginagamit sa pagtukod sang una nga modelo, kag ang nabilin nga mga subunits (protein-W) Modeling. Sa PHENIX (49). Idugang ang bisan ano nga nadula nga mga pagkasunod-sunod sa resulta nga modelo sa Coot (48), kag dayon mano-mano nga pino ang bug-os nga subunit. Ang nabilin nga wala gin-alokar nga densidad nagakabagay sa kombinasyon sang mga lipid (PDB monomer library ID sang CDL = CDL, POPC = 6PL kag POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) kag UQ10 nga mga molekula (U10). Gamita ang PHENIX optimization (49) kag manual optimization sa Coot (48) sa paghimpit sang kompleto nga una nga modelo tubtob nga ang mga estadistika sang modelo kag ang biswal nga kalidad sang pagkaangay indi na mapauswag pa gid. Sa katapusan, gamita ang LocScale (50) sa pagpatalom sang lokal nga mapa, kag dayon maghimo sang pila pa ka mga siklo sang pagmodelo sang wala gin-alokar nga densidad kag awtomatiko kag manual nga pag-optimize.
Ang tagsa ka mga peptide, cofactors kag iban pa nga mga lipid kag quinones nga nagadungka sa sulod sang ila tagsa ka mga densidad ginapakita sa mga Figure 1 kag 2. S18 tubtob S23. Ang estadistikal nga impormasyon sang katapusan nga modelo makita sa Table S1.
Luwas kon may iban nga ginsambit, ang UV/Vis/NIR absorption spectra gintipon sa Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) sa 1 nm nga mga interval halin sa 250 nm tubtob 1000 nm kag ang integration time nga 0.1s.
I-dilute ang sample sa isa ka quartz cuvette nga may 2 mm nga banas pakadto sa A880 sang 1, kag kolektahon ang absorption spectrum sa tunga sang 400 kag 1000 nm. Ang circular dichroic spectra gintipon sa isa ka Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) sa 1 nm nga mga interval sa tunga sang 400 nm kag 950 nm sa isa ka scan rate nga 20 nm min-1.
Ang molar extinction coefficient ginadeterminar paagi sa pag-dilute sang core complex sa isa ka A880 nga ginabanta 50. Dilute ang 10μl nga kadamuon sa 990μl nga binding buffer ukon methanol, kag kolektahon gilayon ang absorption spectrum agud mapagamay ang BChl degradation. Ang BChl nga kaundan sang tagsa ka sample sang methanol ginkalkulo paagi sa extinction coefficient sa 771 nm sang 54.8 mM-1 cm-1, kag ang extinction coefficient napat-od (51). Bahina ang gintakus nga konsentrasyon sang BChl sa 32 (RC-LH114-W) ukon 36 (RC-LH116) sa pagdeterminar sang konsentrasyon sang core complex, nga dayon ginagamit sa pagdeterminar sang absorption spectrum sang pareho nga sample nga nakolekta sa buffer Extinction coefficient. kaanggid. Tatlo ka sulitsulit nga pagsukol ang ginhimo para sa tagsa ka sample, kag ang average nga absorbance sang BChl Qy maximum gingamit para sa pagkalkulo. Ang extinction coefficient sang RC-LH114-W nga gintakus sa 878 nm amo ang 3280±140 mM-1 cm-1, samtang ang extinction coefficient sang RC-LH116 nga gintakus sa 880 nm amo ang 3800±30 mM-1 cm-1.
Ang UQ10 gin-isip suno sa pamaagi sa (52). Sa malip-ot nga pulong, ang reverse phase HPLC (RP-HPLC) ginhimo gamit ang Agilent 1200 HPLC system. I-dissolve ang mga 0.02 nmol sang RC-LH116 ukon RC-LH114-W sa 50μl sang 50:50 methanol:chloroform nga may 0.02% (w/v) ferric chloride, kag i-inject ang pre-equilibrated Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 mml sa 1-1-1-m. 40°C sa HPLC solvent (80:20 methanol:2-propanol) sa ×25 cm nga haligi. Himua ang isocratic elution sa isa ka HPLC solvent sa pag-monitor sang absorbance sa 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) kag 780 nm (BChl) sa sulod sang 1 ka oras. Ang putukputukan sa 275 nm chromatogram sa 25.5 minutos gintingob, nga wala sing iban pa nga makita nga mga compound. Ang gintingob nga lugar ginagamit sa pagkalkulo sang molar nga kadamuon sang UQ10 nga nakuha nga may kaangtanan sa kurba sang kalibrasyon nga ginkalkulo gikan sa pag-indyeksion sang puro nga mga sulundan halin sa 0 tubtob 5.8 nmol (Figure S14). Ang tagsa ka sample gin-analisar sa tatlo ka mga replika, kag ang ginreport nga sayop nagakaigo sa SD sang average.
Ang isa ka solusyon nga nagaunod sang RC-LH1 complex nga may maximum Qy absorption nga 0.1 ginhanda nga may 30 μM nga ginbuhinan nga horse heart cytochrome c2 (Merck, UK) kag 0 tubtob 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tatlo ka 1-ml nga mga sample ang ginhanda sa tagsa ka konsentrasyon sang UQ2 kag gin-incubate sa bug-os nga gab-i sa kadulom sa 4°C agud masiguro ang bug-os nga pagpasibu sa kadulom antes sang pagtakus. Ang solusyon ginkarga sa isa ka OLIS RSM1000 modular spectrophotometer nga may 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm middle kag 0.6 mm outlet slits. Ang 600 nm nga long pass filter ginabutang sa entrada sang sample phototube kag ang reference photomultiplier tube agud indi maglakip sang excitation light. Ang absorbance gin-monitor sa 550 nm nga may integration time nga 0.15 s. Ang excitation light ginapaguwa gikan sa 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) paagi sa fiber optic cable sa 90% nga intensidad paagi sa DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) kag ginapaguwa sa light source sa anggulo nga 90°. Ang measuring beam nagasumpakil sa salaming sa pagbalik sang bisan ano nga kapawa nga wala una nga masupsop sang sample. Bantayi ang absorbance 10 s antes ang pag-iwag sang 50 s. Dayon ang absorbance ginbantayan pa gid sa sulod sang 60 s sa kadulom agud mahibaluan ang kasangkaron kon diin ang quinolol kinaugalingon nga nagapanubo sang cytochrome c23 + (tan-awa ang Figure S8 para sa hilaw nga datos).
Ang datos ginproseso paagi sa pag-fit sang linear initial rate sa sulod sang 0.5 tubtob 10 s (depende sa konsentrasyon sang UQ2) kag pag-average sang mga rate sang tanan nga tatlo ka sample sa tagsa ka konsentrasyon sang UQ2. Ang RC-LH1 nga konsentrasyon nga ginkalkulo sang tagsa ka extinction coefficient gingamit sa pag-convert sang rate sa catalytic efficiency, nga gin-plot sa Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), kag gin-fit sa Michaelis-Menten model agud mahibaluan ang maathag nga Km kag Kcat nga mga balor.
Para sa mga transient absorption measurements, ang RC-LH1 sample gin-dilute sa ~2μM sa IMAC buffer nga may 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) kag 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ang ascorbic acid ginagamit bilang isa ka sakripisyo nga electron donor, kag ang tert-butaclofen ginagamit bilang isa ka QB inhibitor sa pagsiguro nga ang panguna nga RC donor nagapabilin nga nabuhinan (nga amo, indi photooxidized) sa bug-os nga proseso sang pagtakus. Ginabanta nga 3 ml sang sample ang ginadugang sa isa ka custom rotating cell (mga 0.1 m ang diametro, 350 RPM) nga may 2 mm nga kalabaon sang optical path agud masiguro nga ang sample sa laser path may bastante nga tion para sa madulom nga pagpasibu sa tunga sang mga pulso sang pagpukaw. Gamita ang ~100-fs laser pulses sa pagpadaku sang Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, USA) sa pag-excite sang sample sa 880 nm sa repetition rate nga 1 kHz (20 nJ para sa NIR ukon 100 nJ para sa Vis). Antes magtipon sang datos, i-expose ang sample sa excitation light sa sulod sang mga 30 minutos. Ang pagkaladlad magatuga sang QA inactivation (posible nga pagnubo sang QA sing makaisa ukon makaduha). Apang palihug talupangda nga ini nga proseso mahimo mabalik bangod pagkatapos sang malawig nga panahon sang madulom nga pagpasibu, ang RC amat-amat nga magabalik sa hilikuton sang QA. Ang Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) gingamit sa pagtakus sang transient spectra nga may delay time nga -10 tubtob 7000 ps. Gamita ang Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) sa pag-ungroup sang mga data sets, dayon i-merge kag i-standardize. Gamita ang CarpetView software package (Light Conversion Ltd., Lithuania) sa paggamit sang gintingob nga data set sa pagkuha sang differential spectra nga may kaangtanan sa pagkadunot, ukon gamita ang isa ka function nga nagalakip sang madamo nga mga exponent nga may instrumento nga sabat sa pag-igo sa single-wavelength spectral evolution sa Origin (OriginLab, USA).
Subong sang ginsambit sa ibabaw (53), ang isa ka photosynthetic film nga may LH1 complex nga kulang sa RC kag peripheral LH2 antenna ginhanda. Ang membrane ginlasaw sa 20 mM tris (pH 8.0) kag dayon ginkarga sa isa ka quartz cuvette nga may 2 mm optical path. Ang 30nJ laser pulse gingamit sa pag-excite sang sample sa 540 nm nga may delay time nga -10 tubtob 7000 ps. Iproseso ang data set suno sa ginlaragway para sa Rps. pal sample.
Ang membrane gin-pellet paagi sa centrifugation sa 150,000 RCF sa sulod sang 2 ka oras sa 4°C, kag dayon ang absorbance sini sa 880 nm gin-resuspended sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kag 200 mM NaCl. Tunawon ang membrane paagi sa mahinay nga pag-uyog sa 2% (w/v) β-DDM sa sulod sang 1 ka oras sa kadulom sa 4°C. Ang sample ginlasaw sa 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) sa isa ka konsentrasyon sang protina nga 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Ang dugang nga pagproseso ginhimo gikan sa nauna nga ginbalhag nga pamaagi (54), nga nagasugod sa paglasaw sang 50 μg nga protina sa kabug-usan nga 50 μl TEAB nga nagaunod sang 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Pagkatapos sang sonication sa sulod sang 60 s, ginbuhinan ini gamit ang 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) sa 37°C sa sulod sang 30 minutos. Para sa S-alkylation, i-incubate ang sample nga may 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) kag idugang ini gikan sa 200 mM isopropanol stock solution sa sulod sang 10 minutos sa temperatura sang kwarto. Ang proteolytic digestion ginhimo paagi sa pagdugang sang 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) kag gin-incubate sa 37°C sa sulod sang 3 ka oras. Ang laurate surfactant ginkuha paagi sa pagdugang sang 50 μl ethyl acetate kag 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) kag pag-vortexing sa sulod sang 60 s. Ang pagbulagay sang hugna ginpasanyog paagi sa centrifugation sa 15,700 RCF sa sulod sang 5 ka minutos. Suno sa protocol sang manufacturer, ang C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) gingamit sa maid-id nga pag-aspirate kag pag-desalt sang mas manubo nga hugna nga nagaunod sang peptide. Pagkatapos sang pagpamala paagi sa vacuum centrifugation, ang sample gintunaw sa 0.5% TFA kag 3% acetonitrile, kag 500 ng ang gin-analisar paagi sa nanoflow RP chromatography nga gin-updan sang mass spectrometry gamit ang mga parameter sang sistema nga gindetalye sang una.
Gamita ang MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para sa pagkilala kag pag-isip sang protina sa pagpangita sang Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Ang mass spectrometry proteomics data gindeposito sa ProteomeXchange Alliance paagi sa PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sa idalom sang dataset identifier PXD020402.
Para sa pag-analisar paagi sa RPLC nga gin-updan sang electrospray ionization mass spectrometry, ang RC-LH1 complex ginhanda gikan sa wild-type Rps. Gamit ang nauna nga ginbalhag nga pamaagi (16), ang konsentrasyon sang protina nga ginhimo sa mga selula sang palustris amo ang 2 mg ml-1 sa 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl kag 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Suno sa protocol sang manufacturer, gamita ang 2D purification kit (GE Healthcare, USA) sa pagkuha sang 10 μg nga protina paagi sa pamaagi sang pag-ulan, kag tunawon ang precipitate sa 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile kag 20% ​​(v/v) nga tubig. Lima ka microliters ang gin-analisar paagi sa RPLC (Dionex RSLC) nga gin-updan sang mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gamita ang MabPac 1.2×100 mm nga haligi (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa pagbulag sa 60°C kag 100μlmin -1, nga may gradient nga 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA kag 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] to solvent (85%) Bv/v) [0.1%(v/v) FA kag 0.02%(v/v) sa 90%(v/v) acetonitrile TFA] Gamit ang standard electrospray ionization source kag default parameters sa sulod sang masobra 60 minutos, ang mass spectrometer nagakuha sang 100 tubtob 2750 m/z (mass to-charge ratio). Sa bulig sang ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), i-mapa ang mass spectrum sa mga subunits sang complex.
Ang mga selula ginpatubo sa sulod sang 72 ka oras sa idalom sang 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) ukon mataas (300μMm-2 s-1) nga kapawa. M22 medium (M22 medium nga ang ammonium sulfate wala ginlakip kag ang sodium succinate ginbuslan sang sodium acetate) sa 100 ml nga screw-top bottle (23). Sa lima ka 30-s nga siklo, ang 0.1 micron nga mga bildo nga mga kuwintas gin-bead sa volume ratio nga 1:1 sa pag-lyse sang mga selula kag ginpabugnaw sa yelo sa sulod sang 5 minutos. Ang indi matunaw nga butang, wala mabali nga mga selula kag mga kuwintas nga bildo ginkuha paagi sa centrifugation sa 16,000 RCF sa sulod sang 10 minutos sa isa ka benchtop microcentrifuge. Ang membrane ginseparar sa Ti 70.1 rotor nga may 100,000 RCF sa 20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga may 40/15% (w/w) sucrose gradient sa sulod sang 10 ka oras.
Subong sang ginlaragway sa amon nauna nga buluhaton, ang immunodetection sang His tag sa PufW (16). Sa malip-ot nga pulong, ang gintinluan nga core complex (11.8 nM) ukon ang membrane nga nagaunod sang pareho nga konsentrasyon sang RC (nga napat-od paagi sa oxidation nga nagabuhin sang ginbuhinan nga kinalain nga spectrum kag nagapares sang load sa stained gel) sa 2x SDS loading buffer (Merck, UK) nga ginlasaw sing makaduha. Ang mga protina ginseparar sa isa ka replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Ang isa ka gel ginmantsahan sang Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) sa pag-load kag pag-visualize sang RC-L subunit. Ang protina sa ikaduha nga gel ginsaylo sa methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) para sa immunoassay. Ang PVDF membrane ginbalabagan sa 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 kag 5% (w / v) skimmed milk powder, kag dayon gin-incubate upod ang anti-His primary antibody (sa Dilute the antibody buffer [50 mM-HCl) 7.6), 150 mM NaCl kag 0.05% (v/v) Tween-20] sa 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) sa sulod sang 4 ka oras. Pagkatapos sang paghugas sing 3 ka beses sa sulod sang 5 ka minutos sa antibody buffer, ang membrane gintingob sa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (ginlasaw sing 1:10,000 sa antibody buffer) I-incubate agod tugutan ang pagtukib (5 minutos pagkatapos sang 3 ka paghugas sa antibody buffer) nga nagagamit sang WAR ETA 2000. chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) kag Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Paagi sa pagdrowing sang intensity distribution sang tagsa ka stained gel ukon immunoassay lane, nga nagatingob sang lugar sa idalom sang peak kag nagakalkulo sang intensity ratio sang RC-L (stained gel) kag Protein-W (immunoassay), sa ImageJ (57) Proseso ang laragway. Ini nga mga ratio ginbaylo sa molar ratios paagi sa pagpati nga ang ratio sang RC-L sa protina-W sa puro nga RC-LH114-W nga sample amo ang 1:1 kag gina-normalize ang bug-os nga data set suno sa sini.
Para sa mga dugang nga materyales para sa sini nga artikulo, palihog tan-awa ang http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Isa ini ka bukas nga artikulo nga ginapanagtag sa idalom sang mga termino sang Creative Commons Attribution License. Ang artikulo nagapahanugot sang wala sing limitasyon nga paggamit, pagpanagtag, kag pagkopya sa bisan ano nga medium sa idalom sang kondisyon nga ang orihinal nga obra ginsambit sing nagakaigo.
Pahibalo: Ginapangabay lang namon sa imo nga ihatag ang imo email address agud mahibaluan sang tawo nga imo ginarekomendar sa pahina nga luyag mo nga makita nila ang email kag indi ini spam. Indi kami magkuha sang bisan ano nga mga email address.
Ini nga pamangkot ginagamit sa pagtilaw kon ikaw isa ka bisita kag pagpugong sang awtomatiko nga pagsumiter sang spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoilter.
Ang mataas nga resolusyon nga istruktura sang light trap 1 complex sa sentro sang reaksyon nagahatag sang bag-o nga mga panan-awan sa dinamika sang quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil Necoilter.
Ang mataas nga resolusyon nga istruktura sang light trap 1 complex sa sentro sang reaksyon nagahatag sang bag-o nga mga panan-awan sa dinamika sang quinone.
©2021 Asosasyon sang Amerika para sa Pag-uswag sang Siyensya. ang tanan nga mga kinamatarong gintigana. Ang AAAS isa ka partner sang HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef kag COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.